启动子甲基化调控NK92MI细胞KIR3DL1基因表达.docVIP

启动子甲基化调控NK92MI细胞KIR3DL1基因表达 　【摘要】 目的: 观察NK细胞系NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子区的甲基化模式及去甲基化和组蛋白乙酰化对基因表达的影响, 探讨KIR3DL1基因的表达调控机制。方法: 采用亚硫酸氢盐测序法检测NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子区的甲基化状况, 应用甲基化抑制剂5氮胞苷和（或）组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂曲古抑菌素A处理NK92MI细胞以诱导CpG岛去甲基化和组蛋白乙酰化, 观察启动子区CpG岛甲基化和组蛋白乙酰化与KIR3DL1基因表达的关系。结果: NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子区高甲基化, CpG二核苷酸甲基化频率在70%～100%之间; 应用终浓度为2.5 μmol/L和5 μmol/L的5氮胞苷作用72 h可以诱导NK92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达量分别增加66.6%和114.6%; 单用终浓度为50 nmol/L的曲古抑菌素A不能诱导NK92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达量增加; 此外, 曲古抑菌素A和5氮胞苷联用与单用5氮胞苷相比也没有协同作用。结论: NK92MI细胞中KIR3DL1基因表达受启动子甲基化调控。 【关键词】 杀伤细胞抑制性受体 基因表达调控 DNA甲基 组蛋白乙酰化 　　HLA半相合异基因造血干细胞移植具有广泛的临床应用前景, 但伴随的问题是移植物抗宿主病发生率高, 免疫重建缓慢, 感染机会增加, 如何克服这些问题是目前造血干细胞移植领域的研究热点。近年来一系列重要的临床研究发现, 在去除T细胞的HLA半相合异基因造血干细胞移植中, 杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immnoglobulinlike receptor, KIR）表型不合（移植物抗宿主方向）是对预后有利的因素[1-4]。KIR基因家族是表达在人自然杀伤（nature killer, NK）细胞和部分T细胞表面的具有调节功能的细胞表面分子家族, 它通过与靶细胞表面相应的HLA I类分子结合, 传导激活或抑制信号, 调节NK细胞功能[5]。KIR基因在NK细胞表面呈随机性、 多样性的表达模式, 由此形成了多种多样的能够特异性的识别、 清除异常细胞的NK细胞群[6]。因此, 只有了解KIR基因表达调控机制, 才能进一步明确NK细胞的生物学特性, 才能使人为调控NK细胞活性为临床应用成为可能。但是, 目前关于KIR的表达调控机制尚不完全清楚。本研究旨在从表观遗传学的角度对KIR3DL1基因的表达调控机制进行深入研究。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 人NK细胞系NK92MI购自美国ATCC细胞库; 5氮胞苷（5azacytidine, Aza）、 曲古抑菌素A（trichostatin A, TSA）、 肌醇、 巯基乙醇、 叶酸均购自Sigma公司; 氢醌和亚硫酸氢钠由上海生化试剂公司生产; αMEM培养基、 TRIzol RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司; 马血清、 胎牛血清购自Hyclone公司; DNA提取试剂盒（Wizard Genomic DNA Purification Kit）、 MMLV逆转录酶、 dNTPs、 oligo(dT)18、 pGEMT easy载体、 T4 DNA连接酶、 感受态大肠杆菌JM109均购自Promega公司; Taq酶购自TaKaRa公司; PCR产物回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit）购自Qiagen公司; PCR引物合成及测序均由北京奥科生物技术有限公司完成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 NK92MI细胞用含2 mmol/L左旋谷氨酰胺、 1.5 g/L NaHCO3、 0.2 mmol/L肌醇、 0.1 mmol/L巯基乙醇、 0.02 mmol/L叶酸、 125 mL/L马血清、 125 mL/L胎牛血清的αMEM培养基, 于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度条件下培养、 传代。 　　1.2.2 总RNA及DNA的提取 采用TRIzol RNA提取试剂盒按说明书步骤提取细胞总RNA, 采用Wizard Genomic DNA Purification Kit按说明书步骤提取细胞基因组DNA, 紫外分光光度计定量。 　　1.2.3 DNA的亚硫酸氢盐修饰 参照文献[7]的方法, 取1 μg经1 mL注射器抽吸剪切后的基因组DNA, 加入去离子水稀释至50 μL, 向其中加入3 mol/L NaOH 5 μL, 37℃孵育25 min使DNA解开双链; 然后加入新鲜配制的10 mmol/L氢醌30 μL及