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地蚕指纹图谱初步探究 　【摘要】 目的建立地蚕药材的反相高效液相色谱（RP-HPLC）指纹图谱研究方法。方法高效液相色谱法，Lichrospher C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），乙腈-0.25%磷酸水梯度洗脱,流速1.0 ml/min，检测波长350 nm，柱温35℃。 结果10批药材共标定了25个共有峰。结论利用地蚕RP-HPLC指纹图谱分析方法较全面地反映地蚕药材的内在质量，可用于地蚕药材的质量控制。 【关键词】 地蚕 指纹图谱 地蚕又名肺痨草，为唇形科水苏属植物地蚕Stachys geobombycis C.Y.Wu的全草及地下部分，主产于浙江、江西、福建等地。该药味淡，微甘，性平，归肺、肾经，具有益肾润肺、滋阴补血、清热除烦等功能，用于治疗咳嗽、哮喘等［1］，化学研究［2］报道其有金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、齐墩果酸等成分。杨中林等［3］以金丝桃苷为对照品高效液相色谱（HPLC）法测定地蚕药材含量。但对地蚕的质量控制方面的研究较少。为了进一步对地蚕药材质量进行科学评价，本实验采用HPLC法对不同产地不同采集时间的地蚕进行指纹图谱的研究，同时进行了系统适应性实验和方法学考察，为地蚕药材的鉴定与质量评价提供依据。 1 仪器与试药 1.1 仪器日本岛津LC-20AB高效液相色谱仪( PDA检测器,LC-solution色谱工作站）。 1.2 试药金丝桃苷对照品(南京青泽医药开发有限公司，含量测定98.48%，批号070415)；地蚕药材经江苏省药品检验所董小平主任药师鉴定；乙腈(色谱纯,山东禹王实业有限公司)；冰醋酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)，水（二次重蒸水）经过0.45 μm水系滤膜过滤。 2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱Lichrospher C18柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)，检测波长为350 nm，进样量10 μl，柱温35℃，流速1.0 ml/min，流动相梯度如表1，记录时间为100 min。此条件下对照品金丝桃苷的保留时间18.773 min。 2.2 供试品溶液的制备 精密称定粉碎后的地蚕样品约5 g，加入75 ml甲醇，回流30 min，滤过，将药液浓缩至干，用少量水溶解，分别用石油醚和醋酸乙酯依次萃取，醋酸乙酯层浓缩至干，甲醇定容于5 ml量瓶中，摇匀，微孔滤膜滤过，即得。表1 流动相梯度 2.3 对照品溶液的制备 精密称取金丝桃苷对照品1 mg，用甲醇溶解，定容于25 ml量瓶中(浓度为 40 μg/ml)，摇匀即得。 2.4 方法学考察 取地蚕样品进行指纹图谱预试验，按上述色谱条件，可得到分离度较好、各峰分布较均匀的指纹图谱，并着重选择了地蚕峰面积较大的13个峰，进行方法学考察。 2.4.1 精密度实验 精密吸取供试品溶液10 μl，按上述色谱条件，连续进样5次，记录色谱图。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本一致，RSD均小于3.0%，符合指纹图谱色谱技术要求。 2.4.2 稳定性实验 取同一供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0，2，4，8，12，24 h进样检测，记录色谱图。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值基本一致，RSD均小于3.0%，说明供试品溶液在24 h内稳定，符合指纹图谱技术要求。 2.4.3 重复性实验 分别精密称定同一批药物5份，同法制备样品，进样，记录色谱图。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值基本一致，RSD均小于3.0%，符合指纹图谱技术要求。 2.5 指纹图谱及技术参数［4］ 2.5.1 指纹图谱选择及特征峰的标定根据10批供试品HPLC图谱，选择7号供试品作为对照指纹图谱（见图1）。地蚕药材中金丝桃苷为其主要成分，从指纹图谱中可以看出金丝桃苷色谱峰（保留时间RT≌18.833 min，峰面积百分比A%≌20.05%）积分面积最大，作为参照峰，同时得到各批次地蚕药材25个共有峰。 　 图1 地蚕药材的对照指纹图谱 2.5.2 地蚕指纹图谱相似度计算 按上述实验方法检测10批地蚕药材的指纹图谱（见图2），应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(A版，国家药典委员会)计算10批药材的相似度，结果分别为：0.980，0.925，0.945，0.972，0.986，0.978，1.000，0.991，0.968，0.967。 图2 10批地蚕药材的指纹图谱 2.5.3 共有峰相对保留时间及相对峰面积的比较 参照《中药注射液指纹图谱研究的技术要求(暂行)》［4］，对地蚕药材进行HPLC色谱指纹图谱测定分析，以参照物金丝桃苷(2号峰)的保留时间和峰面积为1，计算10批指纹图谱中25个共有峰的相对保留时间及相对峰峰面积。见表2～3。 表2 10批供试品共有特征指纹