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复元胶囊对软骨细胞凋亡P38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路影 　【摘要】 目的： 观察复元胶囊含药血清对体外培养软骨细胞凋亡及P38丝裂原活化蛋白激酶信号通路（P38MAPK）的影响. 方法: 建立体外原代软骨细胞培养体系,制备复元胶囊含药血清,采用硝普钠（SNP）诱导软骨细胞凋亡，并用复元胶囊含药血清以及P38MAPK的特异阻断剂SB203580干预. 透射电镜观察软骨细胞凋亡的超微结构，流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率的变化，比色法观察Caspase3活性变化，免疫印迹技术（Western Blot）检测磷酸化P38, P53蛋白表达水平. 结果： ① 电镜下可观察到典型的凋亡细胞形态；② 中药组软骨细胞凋亡率（29.18±0.81）%比模型组（39.73±0.55）%显著降低，中药+抑制剂组软骨细胞凋亡率（25.85±0.85）%也比抑制剂组（27.27±0.78）% 低，差异均具有统计学意义（Plt;0.01，Plt;0.05）；③ 中药组凋亡执行因子Caspase3的活性为（1.69±0.31） μg/μL，低于模型组（2.78±0.19） μg/μL，中药+抑制剂组（0.95±0.06） μg/μL与抑制剂组（1.17±0.13） μg/μL比较，Caspase3的活性也降低，差异均具有统计学意义（Plt;0.01，Plt;0.05）；④ 中药组pP38蛋白表达（0.84±0.06）与模型组（1.98±0.19）比较显著降低，差异有统计学意义（Plt;0.01）；而中药+抑制剂组pP38表达（0.32±0.03）与抑制剂组（0.36±0.04）比较无明显变化，差异无统计学意义（Pgt;0.05）；⑤ P53蛋白在中药组（2.78±0.34）表达明显降低，与模型组（5.50±0.54）比较，差异均有统计学意义（Plt;0.01）；中药+抑制剂组（0.92±0.02）与抑制剂（1.41±0.09）组比较，P53蛋白表达也降低. 结论： 复元胶囊含药血清能通过抑制磷酸化P38表达、调节P38信号通路下游靶基因P53和凋亡执行因子Caspase3而抑制SNP诱导的软骨细胞凋亡. 【关键词】 软骨细胞；细胞凋亡；P38丝裂原活化蛋白激酶类；复元胶囊 　　0引言 　　软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，在软骨形成、代谢以及修复中起着极其重要的作用［1］. 在骨关节炎病变过程中软骨细胞凋亡已被认为是关节软骨退行性改变的病理因素之一［2-3］. 在NO供体硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）诱导的软骨细胞凋亡信号传导过程中, P38 MAPK信号通路参与了凋亡信号的转导［4］. 但目前国内外从信号转导的角度研究药物治疗骨关节炎的文献报道尚少. 复元汤是由晒参、淫羊藿、鹿茸、黄芪、川芎、当归、枸杞子、三七等组成，是临床上长期用于治疗骨关节炎并有明显疗效的实验制剂. 本实验建立软骨细胞体外培养体系，观察复元胶囊含药血清对SNP诱导的软骨细胞凋亡的影响，并从信号转导的角度探讨其作用机制. 　　1材料和方法 　　1.1材料雄性3 wk龄清洁级SD大鼠10只，平均体质量（50±5） g；雄性成年普通级SD大鼠20只，平均体质量（220±10） g（由重庆医科大学实验动物中心提供）. 复元胶囊由晒参、淫羊藿、鹿茸、黄芪、川芎、当归、枸杞子、三七等组成，委托重庆希尔安药业有限责任公司制成胶囊，仅供实验使用. SNP粉针剂（批号：H111021635，北京双鹤现代医药技术有限责任公司）；FD（F12∶DMEM=1∶1）培养基、优级胎牛血清（美国Hyclone公司）；Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公司）；胰蛋白酶（美国Gibic公司）；总蛋白提取试剂盒（中国升博生物公司）；P38MAPK抑制剂SB203580（中国上海康成生物公司）；Annexin VFITC试剂盒(中国晶美生物工程有限公司)；Caspase3比色法检测试剂盒（美国Bio Vision公司）；磷酸化抗体P38(美国cell signaing公司)；P53抗体、蛋白内参βactin(美国Santa Cruz公司)；PBS缓冲液、辣根酶标记兔抗山羊IgG（中国北京中衫生物技术有限公司）；免疫印迹化学发光试剂（中国碧云天生物公司）；PVDF膜（美国Millipore公司）；SWCJ2A型净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；200113型二氧化碳培养箱（上海常思工贸有限公司）；CK2型倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司）；7500型透射电镜（日本HITACHI公司）；FACS Aria型流式细胞分析仪（美国BD公司）；凝胶成像仪（美国BioRad公司）；ELX800型酶标仪（德国Gene公司）. 　　1.2方法 　　1.2.1软骨细胞的分离、培