复方丹参在JEG-3滋养细胞系氧化应激中保护作用.docVIP

复方丹参在JEG-3滋养细胞系氧化应激中保护作用 　 作者：侯延庆 ，王自能，王冬菊 【摘要】 目的探讨复方丹参在滋养细胞氧化应激中的保护作用。方法用不同浓度(0，1.25，2.50，12.50 mg/ml)的复方丹参对滋养细胞JEG-3进行预处理后，用5 mmol/L的过氧化氢(H2O2)诱导建立氧化应激模型。细胞的存活率、细胞内氧化应激水平、细胞裂解液中丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活性和mRNA表达分别用噻唑盐(MTT)法、活性氧(ROS)探针(DCFH-DA)法、化学比色和荧光定量RT-PCR检测。结果与未加丹参组(0mg/ml)比较，经复方丹参(1.25，2.50 mg/ml)预处理的滋养细胞，H2O2氧化损伤后,细胞的存活数明显升高，ROS产生及MDA含量明显减少，SOD活性及SOD-mRNA含量升高(Plt;0.01)。而高浓度组(12.50 mg/ml)细胞存活数下降，ROS、MDA、SOD及mRNA值均较低浓度组减少(Plt;0.01)。结论低浓度的复方丹参注射液对滋养细胞的氧化损伤有保护作用，可能通过上调SOD mRNA的转录及增强SOD酶活性起抗氧化作用。 【关键词】 复方丹参; 氧化应激; 滋养细胞 子痫前期(Preeclampsia,PE)严重威胁孕产妇和围生儿的健康和生命,其发病机制尚不清楚。目前观点认为PE是两阶段疾病，第1阶段胎盘浅植入-胎盘灌注减少,胎盘缺血、缺氧，局部出现氧化应激。胎盘局部的氧化应激通过多种机制引发母体血管内皮的损伤和炎症反应，导致第2阶段母体胎儿综合症的出现[1～3]。因此胎盘滋养细胞的氧化应激可能是PE发病机制中两阶段联系的首要因素[4]。从理论上来说，应用抗氧化剂对于该病的预防和治疗应有较好的效果。中药复方丹参注射液是丹参、降香两味中药经提取精制而成，其有效成分是丹参酮,它可扩张冠状动脉，抑制血小板聚集及直接清除氧自由基并能改善微循环而增加组织供血供氧，降香能行气祛瘀，被广泛应用于冠心病、心绞痛、心肌炎、肺心病、糖尿病等[5，6]的活血化瘀治疗。由于PE属“血瘀”的范畴,中医临床上常可采用活血化瘀的中药对其进行治疗。采用中药丹参治疗时通过改善母体内NO 、PGI2 、ET和TXA2 的病理状况,起到一定的血管舒张作用,用药后可使血压明显下降、症状明显减轻[7]。本实验采用滋养细胞来源的JEG-3 细胞在细胞水平上进行复方丹参抗氧化作用的基础研究，为临床治疗提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞和试剂来源JEG-3细胞株购自北京协和细胞资源中心。复方丹参注射液由正大青春宝药业有限公司生产，批号为每支10 ml，每毫升含丹参和降香各1 g。RP1640培养基为Gibco公司产品，Trizol购自Invitrogen 公司。胎牛血清为天津TBD生产。MTT购自Sigma公司，蛋白裂解液、活性氧(ROS)、丙二醛(MAD)及超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。定量PCR用酶SYBR Green PCR Master Mix 购自TOYOBO 公司，定量PCR 仪：ABI PRISM 7300 Sequence Detection System，定量PCR 反应体系为ABI公司产品，紫外/可见分光光度计LAMBDA 45为PerkinElmer 公司产品，全自动(荧光)酶标仪为TZCAN-SAFIRQ-2 奥地利TZCAN公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养JEG-3 细胞在含10 %胎牛血清的RP1640培养液37℃、5 % CO2条件下培养传代,初始接种密度为5×104 /cm2，待细胞融合时,将JEG-3细胞根据所加丹参终浓度分4组(以下复方丹参简称DS)：对照组、DS1、DS2、DS3，DS终浓度(参照文献[8，9])分别为0，1.25，2.50 mg/ml和12.50 mg/ml。将各组JEG-3细胞用含0.1%的牛血清白蛋白的RP1640培养基(不含血清)培养24 h，次日，加入5 mmol/L H2O2共孵育3h以诱导氧化应激[10]。然后以PBS洗3次以备后续分析。 　　1.2.2 MTT法检测细胞存活率将JEG-3细胞置96孔板经复方丹参和H2O2预处理后，向各组每孔内加入5 mg/ml的 MTT 20μl，置于37℃条件下孵育4 h，吸弃上清液，加入100μl二甲基亚砜，振荡数分钟，用全自动酶标仪(波长为490 nm)测定每孔OD值。 　　1.2.3 DCFH-DA法测细胞内ROS水平ROS检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA 本身没有荧光，可以