大豆胰蛋白酶抑制剂分离提纯及降糖活性探究.docVIP

大豆胰蛋白酶抑制剂分离提纯及降糖活性探究 　作者：程晓明 郭瑞华 王和平 焦丽艳 李扬 【摘要】 目的研究大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的治疗效果。方法以市售大豆为材料，经酸浸、脱脂、硫酸铵沉淀、透析除盐、葡聚糖凝胶G-75柱纯化等方法进行大豆胰蛋白酶抑制剂的分离提纯。然后，用大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠灌胃给药。通过比较正常对照组、实验对照组、大豆抑蛋白酶抑制剂高中低剂量组的多项血液指标（血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇）及各组小鼠病理切片等，研究大豆胰蛋白酶抑制剂的降糖活性。结果给予大豆胰蛋白酶抑制剂灌胃的糖尿病小鼠其血糖水平明显下降，甘油三酯水平下降，总胆固醇水平和高密度脂蛋白胆固醇水平无明显变化。结论大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对糖尿病有较显著的疗效。 【关键词】 大豆 胰蛋白酶抑制剂 分离提纯 糖尿病 小鼠胰蛋白酶 　抑制剂（soybean trypsin inhibitor,SBTI）是一类可以抑制胰蛋白酶水解活性的小分子多肽，普遍存在于植物的储藏器官，如种子、块根和块茎中［1］。大豆胰蛋白酶抑制剂已在多种医药领域有所应用［2,3］，另有报道大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调可能有一定效果［4］，但未见SBTI对糖尿病治疗效果的专项研究，本文就大豆胰蛋白酶抑制剂对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的治疗作用进行研究和探索。 1 材料与仪器 1.1 试剂与药品市售大豆，牛胰蛋白酶(1∶250，上海维编科贸有限公司），BAPNA·HCl(Na-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐，上海维编科贸有限公司)，Tris(三羟甲基氨基甲烷，成都化学试剂厂生产)，Sephadex G-75（葡萄糖凝胶G-75，上海化学试剂厂生产），Alloxan（四氧嘧啶，sigma公司），葡萄糖试剂盒-GLU(氧化酶法，液体，北京北化康泰临床试剂有限公司)，高密度脂蛋白胆固醇试剂盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），甘油三酯试剂盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），总胆固醇试剂盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），肝素钠（江苏万邦生化医药股份有限公司），硫酸铵，正己烷，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，36%乙酸等均为国产分析纯。 1.2 仪器DS-1高速组织捣碎机（上海标本模型厂），DF206电热鼓风干燥机（北京医疗设备二厂），FA1004电子天平（科大创新股份有限公司中佳分公司），KDC-1042低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），722分光光度仪（上海精密科学仪器有限公司），电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），AE240电子天平（METTLER公司）。 2 方法与结果 2.1 胰蛋白酶抑制剂的分离纯化 2.1.1 大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）粗提物的制备用酸抽提法所得粗品蛋白和抑制剂总量高［1］，故本实验采用酸性水溶液浸泡大豆粉末提取大豆胰蛋白酶抑制剂［5,6］。 2.1.2 大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物的透析除盐将抑制剂粗制备物置于透析袋中蒸馏水充分透析7 d，除去盐分。 2.1.3 凝胶柱的制备及抑制剂粗提物的纯化［5,7］参考文献［5,7］中方法，吸出存留缓冲液，加入1 ml样品，用缓冲液进行洗脱，控制流速在2 ml·h-1。流出10 ml后，用干净的试管分部收集，检测每管抑制剂的活性。 2.1.4 大豆胰蛋白酶抑制剂的活性测定［5,7］参考文献［7］中方法，以BAPNA为底物测定胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂的活性。计算其抑制百分率［5］。收集具有抑制活性的洗脱液（即大豆胰蛋白酶抑制剂的提取物）。 2.2 大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对小鼠血糖、甘油三酯、总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇水平的影响 2.2.1 实验性四氧嘧啶糖尿病动物模型的建立随机选取10只小鼠作为正常对照组(Control)。除正常对照组外，其它小鼠禁食12 h后，腹腔注射四氧嘧啶250 mg·kg-1。72 h后尾尖取血，用葡萄糖氧化酶法测定注射四氧嘧啶小鼠的血糖，以血糖值大于11.1 mmol·L-1［8］的小鼠作为四氧嘧啶糖尿病模型小鼠。将糖尿病模型小鼠随机分为实验对照组(Alloxan) 、大豆胰蛋白酶抑制剂低剂量组(Alloxan+ SBTIL) 、大豆胰蛋白酶抑制剂中剂量组(Alloxan +SBTIM) 和大豆胰蛋白酶抑制剂高剂量组(Alloxan+SBTIH)。 2.2.2 分组给药及测定方法Alloxan+SBTIL组、Alloxan+SBTIM组和Alloxan+ SBTIH组的定时给药剂量分别为每只每天0.1，0.3 ml和0.5 ml。但为了消除不同给药剂量对实验结果的影响，需将Alloxan+SBTIL组和Alloxan+S