导向性IFNα2aαMSH基因克隆、表达、纯化及鉴定.docVIP

导向性IFNα2aαMSH基因克隆、表达、纯化及鉴定 　【关键词】 干扰素α2a；α促黑素；大肠杆菌；基因表达；pET22b(+)载体 　　IFNα2a是一种具有抗肿瘤活性的细胞因子，已被FDA批准用于多种恶性肿瘤的治疗，但因其在临床治疗中需大剂量长期给药且常会引发明显的毒副作用，使其应用受到一定的限制. αMSH是一种由多种细胞分泌的含13肽的激素，也是一种天然存在的多肽，目前的研究证实其可通过免疫调节作用抑制恶性黑色素瘤细胞的黏附、侵袭和转移［1-2］. Froidevanx等［3］研究表明所有黑素细胞和黑素瘤细胞都表达αMSH受体MC1R，且黑素瘤细胞表达MC1R上调，人黑素瘤细胞表面MC1R密度为900~5700结合位点/细胞，而正常状态下人表皮黑素细胞上MC1R不超过100个结合位点/细胞. 我们利用基因重组技术，构建导向性IFNα2aαMSH融合基因表达载体，并诱导其在大肠杆菌中表达，旨在为恶性黑色素瘤的靶向性治疗提供基础资料. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　质粒pET22b(+)、菌种DH5α及RosettagamiTM2(DE3)，药学系生物技术中心保存；各种限制性内切酶，T4 DNA 连接酶以及DNA Marker DL2000（TaKaRa公司）；片段合成与序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成；DNA凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒（Omega公司）；低Mr蛋白标准（MBI公司）；鼠抗人干扰素α（Santa Cruz公司）；羊抗鼠IgGAp（华美工程公司）：显色剂（美国Promega公司）；蛋白胨、酵母粉、低熔点琼脂糖（Spanish公司）；异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG，华美生物工程公司）；其他试剂均为国产分析纯. 　　1.2方法 　　1.2.1IFNα2aαMSH融合基因的克隆 　　按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码αMSH导向肽的核苷酸片段：片段1（48 nt）：5′ GAT CCTCCT ACT CCA TGG AAC ACT TCC GTT GGG GTA AAC CGG TTT AGG3′；片段2（48 nt）：5′ TCG ACC TAA ACC GGT TTA CCC CAA CGG AAG TGT TCC ATG GAG TAG GAG3′. 这两个片段退火后可形成αMSH导向肽的核苷酸片段以及5′端和3′端的粘性末端（BamH I和SalI的酶切位点）； 将合成的两个片段煮沸变性10 min后退火，再与用BamHI和SalI双酶切处理过的pET22b（+）IFNα2aNGR质粒连接，连接产物转化感受态细胞DH5α，培养筛选阳性克隆(图1). 　　1.2.2重组质粒的酶切和测序 　　从抗生素琼脂培养平板中挑取mAb抗性菌落，于LB培养基中培养过夜，提取质粒DNA，用限制性内切酶NdeⅠ和NcoⅠ进行双酶切鉴定及核酸序列分析. 将测序正确者命名为pET22b（+）IFNα2aαMSH. 　　1.2.3重组蛋白的诱导表达 　　重组质粒pET22b(+)IFNα2aαMSH转化感受态细胞RosettagamiTM2(DE3)，挑取mAb接种于含氨苄青霉素（50 mg/L）、四环素（25 mg/L）、链霉素（10 mg/L）及氯霉素（35 mg/L）的LB培养基中，次日清晨按1∶100的比例接种于上述同样条件的LB培养基中，37℃培养至A600 nm=0.4～0.6时加入IPTG至终浓度为1 mmol/L诱导表达，37℃振荡培养4 h，离心收集菌体，行SDSPAGE鉴定. 　　1.2.4IFNα2aαMSH的初步纯化和Western Blot鉴定 　　1.2.4.1超声裂菌重组蛋白 　　IFNα2aαMSH是以包涵体的形式存在，取5 g表达湿菌，将其悬浮于35 mL STE(100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris.Cl, PH 8.0, 1 mmol/L EDTA)中，在冰浴中300 W超声裂菌，超声5 s，间歇10 s，全程20 min，4℃, 10 000 g离心20 min，保留上清，行SDSPAGE鉴定，并与溶菌酶裂菌结果进行比较. 　　1.2.4.2疏水作用层析初步纯化 　　重组蛋白层析柱为Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)；缓冲液A：25 mmol/L Tris.Hcl, 1 mmol/LEDTA, 1 mol/L (NH4)2SO4, pH 7.5；缓冲液B: 25 mmol/L Tris.Hcl,1 mmol/L EDTA, pH 7.5；将超声裂菌上清在冰浴中进行硫酸铵沉淀，硫酸铵的终浓度为400 g/L, 4℃, 10