导流杂交基因芯片技术在人乳头瘤病毒基因分型应用.docVIP

导流杂交基因芯片技术在人乳头瘤病毒基因分型应用 　【摘要】 目的探讨对人乳头瘤病毒(HPV)感染进行准确快速基因诊断和分型的方法。方法采用导流杂交基因芯片技术和实时荧光PCR对75例疑似HPV感染的标本进行基因诊断和分型。结果基因芯片阳性28例,其中单一感染21例,多重感染7例；实时荧光PCR阳性25例。二者在阳性结果中有很好的一致性。结论导流杂交基因芯片技术适合临床筛查HPV感染及对HPV进行基因分型。 【关键词】 乳头瘤病毒 人 基因型 寡核苷酸序列分析 原位杂交 人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是小分子双链DNA病毒,具有强烈嗜上皮性,高度组织和宿主特异性,可致人类皮肤和黏膜异常增生,引起多种良、恶性病变。目前已经鉴定100多种亚型,其中近40种能感染生殖器官。根据其对生殖系统的致癌性不同,可将其分为低危型和高危型[12]。前者包括HPV 6,11,42,43等亚型,主要引发良性增生,如尖锐湿疣；后者包括HPV16,18,31,33,45等亚型,常引起恶性转化,如宫颈癌。由于HPV的致病性与其型别密切相关,所以对其进行检测和分型对宫颈癌的早期筛查、防治、预后判断等具有重要的临床意义。笔者对75例疑似HPV感染的标本同时进行导流杂交基因芯片技术(flowthrough hybridization and gene chip)即凯普导流杂交HPV DNA检测(简称HybrMax)和荧光定量PCR检测,探讨HybrMax在HPV检测中的应用价值。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1标本来源、采集、保存75例标本取自2006年6-12月福建医科大学附属协和医院疑似HPV感染的门诊女性患者,年龄(26±10.6)岁(18～39岁)。采集宫颈口棉拭子标本,将取样后的棉拭子放入备有无菌生理盐水1 mL的加盖微量离心管(1.5 mL)中,采集的样本在室温放置lt;2 h,4 ℃保存＜24 h,-20 ℃保存＜3个月,样本避免反复冻融。 1.1.2试剂及仪器HPV DNA抽提试剂盒(QIA Mini试剂盒,德国QIAGEN公司),HPV基因分型检测试剂盒(中国凯普生物科技有限公司),可检测21种HPV亚型,包括13种高危亚型(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68型)、5种低危亚型(6,11,42,43和44型)和3种中国人群常见亚型(53,66和CP8304型)。另外在膜上还包括用于质量控制的阴性对照点、内对照点(用于监测PCR反应)和Biotin对照点(用于监测显色系统)；HPV6/11、16、和18型实时荧光PCR检测试剂盒(深圳匹基生物有限公司)；扩增仪(PE9700，美国ABI公司)； 荧光定量PCR仪(LightCycler，瑞士Roche公司)；医用核酸分子快速杂分仪（中国凯普公司）。 1.2方法 1.2.1标本DNA提取取上述液体0.5 mL,13 000 r/min离心1 min,弃上清液,利用QIA Mini试剂盒提取DNA,具体操作步骤按试剂盒说明书。 1.2.2HybrMax法检测21种HPV亚型 1.2.2.1标本DNA扩增将水、PCRMIX、Taq酶和DNA模板按要求混匀,反应体系为25 μL。PCR反应条件为20 ℃ 10 min,95 ℃预变性9 min；95 ℃ 20 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s共40个循环,72 ℃延伸5 min。 1.2.2.2导流杂交将扩增后的PCR产物加热变性后冰浴,同时将固定有核酸探针的膜固定在杂交仪上,进行预杂交。把PCR产物加到薄膜上,让样品流入膜内进行导流杂交,清洗除去未结合的DNA,整个杂交过程保持在45 ℃。 1.2.2.3芯片显色及结果判读用封阻液封闭膜,孵育5 min,重复2次。排出封阻液后加入酶标液,25 ℃温育3.5 min。用冲洗缓冲液彻底冲洗膜,除去未结合的酶标液,后加入NBT/BCIP底物显色3～5 min。在显色后1 h内分析结果。 1.2.3实时荧光PCR测定HPV亚型按照试剂 说明书对每份标本检测HPV6/11、16和18等4种亚型。 1.3统计学处理2种方法检测结果比较用秩和检验,P＜0.05为差别有统计学意义。 　 2结果 2.1HybrMax法检测所有膜上阴性对照结果均为阴性,内对照点和Biotin对照点均为阳性。75例样本共28例阳性,其中单一感染21例,复合感染7例。HPV单一感染时,在膜芯片上相应HPV亚型探针位点处可见一蓝紫色斑点,双重或多重感染时,在膜上可见两个或两个以上显色斑点(图1)。 2.2荧光定量PCR检测75例样本共检出25例阳性,其中单一HPV6/11亚型阳性15例,单一HPV16亚型阳性3例,单