小鼠双尾C蛋白Bicc1多克隆抗体制备及细胞内定位初步探究.docVIP

小鼠双尾C蛋白Bicc1多克隆抗体制备及细胞内定位初步探究 　 作者：戴宝贞, 周亮, 付玉龙, 丁镇伟, 李煜, 吴冠青 【摘要】 目的: 制备小鼠双尾C蛋白Bicc1的多克隆抗体并确定其在细胞内定位。方法: 根据生物信息学分析结果, PCR扩增小鼠Bicc1编码61E199A的cDNA片段。将该片段克隆到GST融合蛋白表达载体上, 在IPTG诱导下产生Bicc1N抗原。纯化目的蛋白并制备兔抗Bicc1蛋白多克隆抗体。Western blot鉴定抗体特异性, 并以间接免疫荧光法初步分析该蛋白在细胞内定位。结果: 成功构建Bicc1N片段原核表达载体, 在大肠杆菌中实现可溶性表达, 制备小鼠Bicc1蛋白的多克隆抗体, 并证实该蛋白主要表达于细胞质内。结论: 成功制备了高效价并特异的兔抗Bicc1多克隆抗体, 为进一步研究Bicc1基因产物的生物功能奠定了基础。 【关键词】 小鼠双尾C基因; Bicc1; 多克隆抗体; 多囊肾 双尾C基因 (BicaudalC)首先在果蝇（Drosophila）中发现, 其功能丧失导致果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎头部的缺失和双尾结构的形成［1］。随后相继在线虫、 爪蟾、 小鼠和人类等物种中发现了果蝇BicaudalC（dBicC）的同源基因。这些同源基因在进化上高度保守: 其蛋白产物均含有N端若干个KH结构域（K homology RNAbinding domain）和C端的一个SAM（Sterile alpha motif）结构域, 它们是蛋白发挥生物功能的关键结构域［2］。KH结构域是RNA结合结构域, 含有该结构域的蛋白通过与RNA结合, 参与mRNA的剪接和翻译, 并维持RNA的稳定性［2, 3］。BicaudalC蛋白C末端的SAM（Sterile alpha motif）结构域一般被认为介导蛋白质之间相互作用, 促进蛋白质同源或异源二聚体的形成［4］。 不同物种BicaudalC同源基因的功能已部分阐明。除了前述果蝇BicC蛋白在发育中的作用, 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的GLD3蛋白能够促进生殖细胞减数分裂并引发精子发生过程［5］; 爪蟾（Xenopus）的xBicC蛋白则通过与RNA的结合涉及早期胚胎发育的胚层特化［6］; 而小鼠Bicc1和人类BICC1基因功能目前还知之甚少［7］。Bicc1基因突变的小鼠表现出与人类多囊肾疾病高度相似的症状, 因而该基因突变的小鼠成为研究人类多囊肾疾病发病机制的理想模型。其中jcpk（juvenile congenital polycystic kidney disease）纯合子小鼠模型的表型与人类常染色体显性多囊肾疾病（autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD）极为相似, 双侧所有肾单元均发生囊肿, 一般出生后10 d死亡。此外, 该基因的突变还影响其他器官如肝脏和胰腺的正常发育和生理功能［7］。 以上证明Bicc1基因突变与小鼠多囊肾的形成密切相关, 提示该基因产物的功能可能与人类多囊肾疾病的发生相关。本研究拟制备小鼠Bicc1蛋白的特异性多克隆抗体, 并分析该蛋白在细胞内的表达分布, 从而为进一步研究小鼠Bicc1基因的功能奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 雄性日本大耳白兔（1.5～2.0 kg）购自中国医科院实验动物中心; Rosetta工程菌为Novagen公司产品; 超滤离心管（截流≥10 KD）为赛多利斯公司产品; LA Taq DNA聚合酶、 限制性内切酶为大连宝生物公司产品; 质粒提取、 PCR产物纯化、 反转录试剂盒及T4连接酶试剂盒为Promega公司产品; TRIzol试剂、 脂质体2000为Invitrogen公司产品; AntiGST单克隆抗体（mAb）为北京天根生化公司产品; DAPI、 Protein G Agarose为Roche公司产品; 弗氏佐剂、 IPTG、 及Flag mAb为Sigma公司产品; 分别标记Cy2、 Cy3的二抗为Jackson ImmunoResearch Laboratories公司产品; DYCP43型蛋白质回收电泳槽为北京六一仪器厂产品; 载体pCMVTag4A为Stratagen公司产品; pGEXHisC3购自Promega公司。 1.2 方法 1.2.1 小鼠Bicc1基因的扩增和真核表达载体的构建 按照相应产品说明书提取小鼠肾脏组织总RNA, 并反转录为cDNA。以该cDNA为模板, 以5′GAGCTCATGGCCTC