山莨菪碱治疗兔创伤性急性肺损伤分子生物学机制实验探究.docVIP

山莨菪碱治疗兔创伤性急性肺损伤分子生物学机制实验探究 　 作者：简文，樊爱琳，尹文，戚好文，柏长青 【摘要】 目的：探讨山莨菪碱（6542）对家兔创伤性急性肺损伤（ALI）治疗作用的分子生物学机制. 方法：采用创伤性急性肺损伤模型，将家兔随机分为对照组（CG），肺损伤组（IG）和治疗组（EG），每组24只. 各组动物分别于肺损伤模型建立后1, 2, 3, 4 h各放血处死6只，留取支气管肺泡灌洗液（BALF），分离肺泡巨噬细胞（PAM），用凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）和RTPCR法检测PAM中NFκB的活性变化及TNFα mRNA的表达水平，用ELISA法检测BALF上清中TNFα和IL8的含量. 结果：IG NFκB活性、TNFα mRNA表达及TNFα, IL8含量于模型建立后1~4 h内均明显高于CG（Plt;0.01）；EG经山莨菪碱治疗后上述指标与IG相比均有明显下降（Plt;0.01, Plt;0.05）. 结论：山莨菪碱对ALI有治疗作用，此作用与其对NFκB活性及TNFα mRNA, TNFα, IL8表达抑制有关. 【关键词】 山莨菪碱；创伤；急性肺损伤；核因子κB；细胞因子 0引言 TNFα等细胞因子的释放及其介导的炎症反应在急性肺损伤（acute lung injury, ALI）的发生、发展中起重要作用［1］. NFκB是一种基因转录调节蛋白，通过调控TNFα和白细胞介素等细胞因子的转录，在炎症、免疫、急性期反应中发挥重要作用［2］. 山莨菪碱是一种植物药，在休克、全身炎症反应综合征的治疗中，显示出一定的保护作用［3］. 此类药物在AIL的防治中也有一定的价值，但作用机制尚不明了［4］. 我们采用分子生物学技术对山莨菪碱治疗创伤性ALI时NFκB活化、TNFα mRNA表达及BALF中TNFα, IL8的释放进行研究，探索其治疗创伤性ALI的可能机制. 1材料和方法 1.1材料健康成年家兔，雌雄不拘，体质量2.0～2.5 kg，由本校动物实验中心提供. Lipopolysaccharide（O111:B4，LPS，Sigma）；NEPERTM试剂盒（Pierce）；Gel Shift Assay 试剂盒（Promega）；γ32P ATP（北京亚辉生物医学工程公司）；Trizol Reagent（Gibco）；RNA PCR试剂盒（大连Takara）；ELISA试剂盒购自本校基础部免疫学教研室. 1.2方法健康成年家兔72只，随机分为正常对照（Control group，CG）、创伤性急性肺损伤（Injury group，IG）和山莨菪碱治疗（Experimental group，EG）3组，每组24只. IG, EG动物LPS注射联合撞击，建立创伤性急性肺损伤模型，CG不做胸壁撞击，静注等量生理盐水代替内毒素. EG动物于模型建立后立即予以山莨菪碱2 mg/kg iv，随后以1 mg (kg/h)维持，CG和IG分别予以等量生理盐水，剂量与方法同EG. 各组分别于模型建立后1, 2, 3, 4 h由颈动脉插管放血处死6只动物. 立即行气管插管，用生理盐水分两次行支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），5 mL/次，共10 mL，回收率70％左右. 将BALF 1000 r/min离心10 min，沉淀用PBS液洗涤后用RPMI 1640培养液悬浮，置于25 mL培养瓶中，37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养1 h，收集贴壁细胞，计数、瑞氏染色证实为巨噬细胞，纯度gt;95%，台盼蓝排斥试验鉴定细胞活力gt;90%. 1.2.1NFκB活性的检测用NEPERTM Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents提取PAM核蛋白，-70℃保存，Bradford法测定蛋白浓度；用γ32P ATP标记NFκB寡核苷酸探针(由Gel Shift Assay 试剂盒提供)（5′AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C3′,3′TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G5′），采用乙醇纯化法纯化，并用凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）测定NFκB的活性，用凝胶图像分析系统对放射自显影胶片进行扫描，以各样品与标准品电泳滞后带的光密度比值来表示NFκB的活性，同时进行特异性及非特异性竞争试验. 1.2.2TNFα mRNA表达用Trizol Reagent试剂盒提取PAM总RNA，采用RTPCR法检测各时间点PAM中TNFα mRNA水平，参照文献方法设计特异引物：TNFα1：5′GCT CA