强精煎抑制实验小鼠睾丸生精细胞凋亡机制探究.doc

强精煎抑制实验小鼠睾丸生精细胞凋亡机制探究 　 作者：宾彬 王杰 陈定雄 莫秋柏 徐杰新 崔锦珠 【摘要】 目的观察强精煎对实验小鼠睾丸Fas和Fasl蛋白表达的影响，探讨其抑制生精细胞凋亡的机制。方法将80只健康雄性昆明种小鼠分为正常组、模型组，强精煎组、黄精赞育胶囊组，除正常组用生理盐水外其他各组均以环磷酰胺注射液40 mg/kg腹腔注射造模，造模成功后，正常组及模型组分别给予蒸馏水，后两组分别给予相应药物灌胃治疗30 d。第31天处死小鼠，利用H-E染色观察小鼠睾丸病理形态，用免疫组织化学SABC法检测Fas和Fasl蛋白在小鼠睾丸实质组织中的表达。结果与模型组比较，强精煎组和黄精赞育胶囊组睾丸Johnson 评分偏高，Fas和Fasl蛋白的表达率偏低(Plt;0.01);与空白组比较，模型组Johnson 评分偏低，Fas和Fasl蛋白表达率偏高(Plt;0.01);强精煎组和黄精赞育胶囊组差异无统计学意义(Pgt;0.05)。结论强精煎可以下调Fas和Fasl蛋白在受损伤小鼠睾丸实质组织中的表达，这可能是其抑制生精细胞凋亡的分子机制之一。 【关键词】 强精煎; 生精功能障碍; 实验研究 大量研究表明，生精细胞的过度凋亡是导致生精功能障碍的重要病因，而Fas/Fasl系统在生殖细胞的凋亡中又起着重要作用[1]。我们前期的研究显示，以补肾健脾为主要功效的中药强精煎具有抑制环磷酰胺所致小鼠睾丸生精细胞过度凋亡的作用[2]，而该作用机制是否也与Fas/Fasl系统有关尚不清楚，为此笔者进行了初步探索。 　　1 材料 　　1.1 药物强精煎(经验方，主要由菟丝子、枸杞子、益母草、当归、党参、牡蛎组成)，为提高本实验的可重复性，采用单味中药配方颗粒，由江苏省江阴天江药业有限公司生产，批号：0803193，将各单味药物倒入量杯，加入100℃蒸馏水，充分混匀，配成药物浓度为0.335 g/ml的混悬液，密封，置4℃冰箱保存备用。黄精赞育胶囊(由何首乌、黄精、菟丝子、枸杞子、五味子、熟地黄等组成)，上海新亚药业邗江有限公司生产， 批号：080101 。去除胶囊外壳，将胶囊内药物颗粒研磨成粉状，80目过筛后，加入蒸馏水继续研末5 min，配成药物浓度为0.037 5 g/ml的混悬液，密封，置4℃保存备用。 　　1.2 试剂注射用环磷酰胺(CP)，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，生产批号以0.9%氯化钠注射液配制成4 mg/ml的溶液，现配现用;Bouin液：将冰醋酸、甲醛、苦味酸饱和水溶液按1∶5∶15比例配制，现配现用;即用型Fas、Fasl多克隆抗体及SABC免疫组化染色试剂盒(标记长臂的生物素羊抗兔IgG、亲和素、过氧化物酶)，底物DAB显色试剂盒，PBS 缓冲液，均购自武汉博士德生物工程有限公司。 　　1.3 动物8～9周龄健康雄性昆明种小鼠80只，清洁级，体重(33±2.58)g，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK桂2003-0003，购回后饲养在广西中医学院动物实验中心，检疫1周，根据体质量采用随机数字表法随机分为4组，即正常组、模型组、黄精赞育胶囊组和强精煎，每组20只。 　　2 方法 　　2.1 造模及给药方法采用环磷酰胺致小鼠生精功能障碍模型，方法参考陈守真法[3]，除正常组给予等剂量生理盐水外，其余各组以环磷酰胺每天按40 mg/kg体重进行腹腔注射，1次/d，连续5 d。造模结束后第1天即给予药物治疗。对照组及治疗组分别灌胃黄精赞育胶囊混悬液或强精煎混悬液0.4 ml/d(按体质量30 g的小鼠体表面积折算均相当于体质量60 kg的成人用量)，正常组和模型组均以等量蒸馏水代替，1次/d，连续30 d。第31天用颈椎脱臼法处死小鼠，取左侧睾丸，放在Bouin液中固定，24 h内取出，用自动脱水机脱水后，用包埋机包埋成蜡块备用。 　　2.2 睾丸组织病理形态的观察将已经用石蜡包埋的睾丸标本切成厚约4 μm的连续石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察其病理形态，采用Johnson 评分法[4]评价精子发生和精子发生障碍的程度。生精功能正常为10分;各期生精细胞存在，但排列紊乱为9分;生精小管中有少量精子(5～10个) 为8分;无精子，但有许多精子细胞为7分;无精子，仅有少量精子细胞(5～10个)为6分;无精子，但有许多精母细胞为5分;无精子细胞，仅有个别精母细胞(lt;5个)为4分;仅有精原细胞为3分;无生精细胞，仅有支持细胞的为2分;管腔内无细胞为1分。评分越高精子发生越好，反之，精子发生障碍程度越严重。 　　2.3 睾丸组织Fas及Fasl蛋白表达情况的检测严格按照博士德公司所提供的免疫组化SABC法操作步骤分别检测Fas和Fasl，用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，用已知的阳性