抑制PI3K-Akt通路提高HeLa细胞化疗效果实验探究.doc

抑制PI3K/Akt通路提高HeLa细胞化疗效果实验探究 　【摘要】 目的 探讨抑制PI3K/Akt信号转导通路提高抗癌药物对人宫颈癌HeLa细胞的杀伤作用。方法 采用MTT法检测Celecoxib、DDP及Docetaxel单独或联合PI3K抑制剂LY294002对人宫颈癌HeLa细胞的抑制率；采用流式细胞技术检测药物单独或联合作用对HeLa细胞凋亡的影响。结果 （1）联合LY294002能够显著提高Celecoxib、DDP及Docetaxel对HeLa细胞抑制率；（2）LY294002与Celecoxib、DDP及Docetaxel的协同治疗指数均小于1，二者起协同治疗作用；（3）联合LY294002能够增加HeLa细胞的凋亡水平。结论 抑制PI3K/Akt信号转导通路能够显著提高Celecoxib、DDP及Docetaxel对HeLa细胞杀伤作用。 【关键词】 PI3K/Akt 协同治疗指数 细胞凋亡 　　0 引言 　　近年的研究表明，磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3kinases，PI3K）在肿瘤信号转导中起着重要的调节作用。细胞在一系列内外因素的作用下，通过启动PI3K/Akt信号转导通路，诱导细胞的增殖、分化，避免细胞发生凋亡。在肿瘤细胞逃避抗癌药物的杀伤过程中，PI3K/Akt信号转导通路可能起了极其重要的作用，因此PI3K/Akt信号转导通路有望成为恶性肿瘤治疗的新靶点。我们进行了PI3K抑制剂联合抗癌药物对肿瘤细胞杀伤作用的研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　人宫颈癌细胞系HeLa细胞为本研究室保存。PI3K抑制剂LY294002购自美国Cell Signaling公司； 多西紫杉醇（Docetaxel）由法国罗纳普朗克乐安公司生产；顺铂(DDP)由江苏豪森药业股份有限公司生产；塞莱西布（Celecoxib）由合肥森瑞化工有限公司生产。RPMI1640培养基购自美国Hyclone公司。FACSort流式细胞仪为美国Becton Dickson公司产品。 　　1.2 细胞培养 　　HeLa细胞由含有10%新生牛血清的RPMI1640培养液于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱培养，实验使用细胞均为接种后24h处于对数生长期细胞。 　　1.3 细胞抑制率测定 　　采用MTT法检测HeLa细胞的抑制率。取对数生长期细胞消化制成细胞悬液，按103～104/孔，每孔200μl接种96孔细胞培养板。37℃、5%CO2饱和湿度培养24h后，加入不同浓度药物，每个样本设8个平行孔。LY294002的终浓度为5，10，20，40，80μM，DDP的终浓度为5，10，20，40，80μg/ml，Celecoxib的终浓度为80，100，120，140，160μmol/L，Docetaxel的终浓度为0.1，0.5，1，5，10μg/ml。两药合用（DDP+LY294002，Celecoxib+LY294002，Docetaxel+LY294002）药物浓度采用1∶1方案。设空白孔对照，给药后继续置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养24h，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl培养4h，彻底吸去培养液，加入二甲基亚砜150μl/孔，震荡10min，酶标仪492nm激光检测吸光度。计算细胞抑制率（抑制率=1－加药物孔的吸光度值/未加药物孔的吸光度值×100%）。实验重复3次。 　　1.4 结果判定 　　根据周廷潮等［1］药物效应中效方程式 fa/fu = ( D/Dm )m，进行中效作图y=logfa/fu，x=log D，y=ax+ b（fa为效应，fa=抑制率，fu为1fa，D为药物浓度，Dm为中效剂量，即0.5效应时的药物浓度，m为斜率)。计算两药单用及合用时的中效浓度（IC50）。然后根据公式计算合用指数（combination index，CI）CI=(D)1/(DX)1+(D)2/(DX)2+α〔(D)1 (D)2〕/〔(DX)1(DX)2〕，(D)1 、(D)2为联合用药达到某一效应时药物1和药物2的浓度，(DX)1、(DX)2为单独用药达到某一效应时药物1和药物2的浓度，α=1为两种相互非排斥性药物，α=0为两种相互排斥性药物。CI＜1协同，CI=1相加，CI＞1拮抗。 　　1.5 细胞凋亡检测 　　分别Celecoxib 80μmol/L，DDP 10μg/μl，Docetaxel 1μg/μl ，LY294002 20μM单独及两药联合（Celecoxib 80μmol/L + LY294002 20μM，DDP 10μg/ml + LY294002 20μM，Docetaxel 1μg/ml + LY294002 20μ