抗人硫氧还蛋白1单克隆抗体制备及鉴定及初步应用.doc

抗人硫氧还蛋白1单克隆抗体制备及鉴定及初步应用 　 作者：唐文心, 王建和, 陈正望, 陈孝平 【摘要】 　　目的: 制备抗硫氧还蛋白1（TRX1）的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法: 以原核表达的TRX1为抗原免疫BALB/c小鼠, 按常规方法进行细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株, 用ELISA 检测mAb腹水的效价、 相对亲和力和进行表位分析, 用Western blot法对mAb的特异性进行鉴定。结果: 得到筛选出3株能稳定分泌抗TRX1的杂交瘤细胞株B6、 D5和E3, 免疫球蛋白亚类均为IgG1 (κ), 腹水mAb效价均在106以上, 3株抗体分别针对不同抗原表位。用mAb建立的竞争抑制ELISA灵敏度达1.22 μg/L。结论: 获得3株特异性好、 亲和力高、 能稳定分泌抗TRX1的杂交瘤细胞株, 为研究TRX1在人类细胞、 血液、 组织中的表达及定位提供了可能, 并为探索相关炎症、 癌症发病机制及新治疗方法提供了强有力的工具。 【关键词】 人硫氧还蛋白 1 单克隆抗体 竞争抑制ELISA 　　硫氧还蛋白1（thioredoxin1, TRX1）相对分子质量（Mr）约为12 000, 属于进化保守的氧化还原蛋白家族, 具有活性中心(TrpCysGlyProCysLys), 它与TRX1还原酶和 NADPH共同构成调节细胞氧化还原状态的巯基氧化还原系统（TRX系统）。1964年TRX1在大肠杆菌中首次被发现至今［1］, 被证实广泛存在于原核、 真核生物中, 具有多种重要功能, 如抑制细胞凋亡、 增加转录因子活性, 刺激细胞增殖及血管生成, 作为DNA合成的辅助因子［2］。临床研究发现, 在氧化应激及炎症状态下包括HIV感染、 类风湿性关节炎、 Sjogrens综合症、 急性冠状动脉综合征和扩张性心肌病等, 患者血清中TRX1水平将大大提高。更有趣的是, 许多人类恶性肿瘤中均发现TRX1的过表达, 包括肺癌、 直肠癌、 肝癌、 胰腺癌、 胃癌、 乳腺癌、 淋巴癌等［3］, 故将TRX1作为一项病理指标并提示可将TRX1及TRX1系统作为癌症治疗的新靶点, 具有潜在的应用价值。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 表达载体pET32a, pcDNA3.1(+)大肠杆菌 DH5α和BL21, 人乳腺癌细胞MCF7细胞株由本实验室保存。 MMLV反转录酶, DNA限制性内切酶, T4 DNA ligase, Klenow酶, pfu聚合酶和 dNTP购自TaKaRa公司。IPTG酵母提取物及胰蛋白胨为 OXOID公司产品。肌动蛋白（βactin）及其单克隆抗体（mAb）、 微管蛋白（βtublin）及其mAb、 牛血清白蛋白（BSA）、 BCA试剂盒及DMEM培养基均为Sigma公司产品。弗氏佐剂为Gibco BRL公司产品。4～6周龄雌性BALB/c小鼠（体质量18～22 g）购自湖北省实验动物研究中心。Sp2/0细胞由中国农业大学传染病与微生物学教研室提供。酶联免疫检测仪为Labsystems dragon公司产品。Sephadex G25凝胶柱为Phamarcia产品。IgG 亚类（型）ELISA检测试剂盒为Pierce公司产品。其他试剂均为国产分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 TRX1的原核表达及纯化 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物对: P1 5′CGGAATTCAATGAACGGCCCTGAAGATCT3′; P2 5′CGGAATTCTCAGCAGCCAGCCTGGAGGA3′。提取人乳腺癌细胞MCF7总 RNA, 用MMLV反转录成cDNA, 以此cDNA为模板, P1和P2作为引物, 用高保真DNA聚合酶pfu进行扩增, 反应程序为: 94℃ 30 s, 55℃ 60 s, 72℃ 40 s, 循环30次。其产物和pcDNA3.1(+)载体连接得到pcDNATRX1。使用Kpn I和Xho I将从pcDNATRX1上将TRX1基因切下后克隆到pET32a的相同位点中, 得到原核表达载体pET32aTRX1。提取pET32aTRX1质粒转化大肠埃希菌 BL21工程菌, 以单菌落接种于 LB培养基（含氨比西林50 mg/L）中振荡培养过夜, 1%转接后继续振荡培养至A值为0.5, 加0.4 mmol/L IPTG诱导表达。将 BL21重悬于预冷的Tris缓冲液（pH7.9, 含5 mmol/L咪唑, 0.5 mol/L NaCl和20 mmol/L TrisHCl）中, 加入10 g/L Triton X100后