抗温及气单胞菌单克隆抗体制备及初步鉴定.doc

抗温及气单胞菌单克隆抗体制备及初步鉴定 　 作者：陈瑞, 唐旭, 于辉, 金晓航, 黄威权, 师建国 毕业论文 【关键词】; 温和气单胞菌;,单克隆抗体;,杂交瘤 毕业论文 　　[摘 要]; 目的: 制备抗温和气单胞菌(Aeromonas sobria, As)单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法: 以灭活的温和气单胞菌免疫BALB/c小鼠, 采用常规杂交瘤技术制备抗温和气单胞菌mAb。用间接ELISA法对mAb的特性进行初步鉴定。结果: 获得6株能稳定分泌抗温和气单胞菌mAb的杂交瘤细胞株, 分别命名为1A8、 2A8、 2F11、 3C6、 3D11、 4G2。经测定杂交瘤细胞培养上清及其诱生的腹水mAb效价分别为1×10-2～1×10-3、 1×10-5～1×10-6。6株杂交瘤细胞系所分泌的mAb亚类是: 2A8、 2F11为IgG1, 1A8、 3D11为IgG2a, 3C6为IgG2b, 4G2为IgG3。其中mAb 3C6经交叉反应试验证明, 与弧菌属其他几种细菌均不起反应, 特异性强。结论: 成功地制备了抗温和气单胞菌mAb的杂交瘤细胞株, 为该病的免疫学诊断及防治提供了基础。 毕业论文 　　[关键词]温和气单胞菌; 单克隆抗体; 杂交瘤 毕业论文 　　温和气单胞菌是我国养殖淡水鱼类及海产品中最常见的致病性弧菌之一[1], 也是我国沿海地区人群中最常见的致病性弧菌之一[2]。此菌可以通过受感染的鱼类经消化道感染人, 造成腹泻、 败血症等疾病而严重威胁人类健康。目前, 对温和气单胞菌病的临床诊断还是依赖临床观察、 解剖及一般细菌学检查方法, 其检测速度和准确性均受到一定的限制。对该菌病的防治主要是使用抗生素及其他化学药物等传统方法, 对鱼类食物的营养品质和环境卫生都存在极大的损害。而单克隆抗体（mAb）应用在致病性细菌的诊断及防治等方面有其他方法所无法比拟的优越性。鉴于国内外尚未见抗该菌mAb的报道,; 我们制备了抗该菌的mAb, 以为该病的免疫学诊断及防治提供基础。 毕业论文 　　1; 材料和方法 毕业论文 　　1.1; 材料; 温和气单胞菌由福建省淡水水产研究所提供, 经第四军医大学附属西京医院检验科全自动细菌生化鉴定仪鉴定证实。骨髓瘤细胞Sp2/0细胞, 系第四军医大学国家“863”课题组惠赠, 融合前使细胞处于对数生长期。BALB/c小鼠8周龄、 雌性, 由本校实验动物中心提供。HRP标记的羊抗鼠IgG抗体购自华美生物工程公司。Ig亚类鉴定试剂盒系本校免疫学教研室惠赠。 毕业论文 　　1.2; 方法 毕业论文 　　1.2.1; mAb的制备; 以40 g/L甲醛溶液灭活的温和气单胞菌为免疫原, 经腹腔免疫BALB/c小鼠(1×108菌体/只)。于1、 7、 14、 21 d各免疫1次, 最后1次免疫3 d后按常规方法进行融合、 筛选、 克隆化及制备腹水[3]。mAb的效价测定和Ig亚类鉴定, 参照文献[3]的方法。mAb与其他相关菌的交叉反应性采用间接ELISA法。 毕业论文 　 　　1.2.2; mAb特性的初步鉴定; mAb与其他相关细菌的反应测定: 豚鼠气单胞菌和嗜水气单胞菌由福建省淡水水产研究所提供, 其他所用标准菌株均购自北京生物制品研究所, 以间接ELISA法检测。 毕业论文 　　2; 结果 毕业论文 　　2.1; 杂交瘤细胞系的建立; 共进行2次细胞融合, 融合率分别为635%、 561%。抗体阳性率分别为283%、 306%。克隆化后, 共获得6株能稳定分泌mAb的阳性细胞株, 分别命名为: 1A8、 2A8、 2F11、 3C6、 3D11和4G2。 毕业论文 　　2.2; mAb的特性鉴定; （1）效价测定: 杂交瘤细胞培养上清及BALB/c小鼠腹水mAb的效价分别为1×10-2～1×10-3和1×10-5～1×10-6。（2）mAb的Ig亚类鉴定:经鉴定2A8、 2F11为IgG1, 1A8、 3D11为IgG2a, 3C6为IgG2b, 4G2为IgG3。（3）mAb与其他相关细菌的交叉反应试验[4, 5]见表1。 毕业论文 　　表1; 抗温和气单胞菌mAb与相关菌的反应性（略） 毕业论文 　　3; 讨论 毕业论文 　　气单胞菌的组成以嗜水气单胞菌和温和气单胞菌占绝对优势[6, 7]。温和气单胞菌是一类主要分布于淡水水体的细菌, 可见于河流、 湖泊、 池塘等多种水域, 鱼类温和气单胞菌感染最严重的是可以引起出血性败血症,此病常暴发流行, 死亡率极高, 严重危害渔业、 水产业的发展。此菌可通过受感染的鱼类或被污染的水源经消化道感染人而造成腹泻, 其引起肝胆疾病及恶性肿瘤等免疫功能低下者的感染病