柴胡皂苷-d对乙醇损伤原代培养大鼠肝细胞保护作用及其机制探究.docVIP

柴胡皂苷-d对乙醇损伤原代培养大鼠肝细胞保护作用及其机制探究 　作者：李素婷 姜凌雪 周晓慧 杨鹤梅 【摘要】 目的研究柴胡皂苷-d（SS-d）对乙醇损伤大鼠原代培养肝细胞保护的作用和机制。方法采用胰蛋白酶消化、分离大鼠肝细胞进行原代培养，乙醇体外诱导肝细胞损伤，以不同浓度的SS-d对肝细胞保护，检测培养液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性和肝细胞内丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活性，MTT法检测肝细胞存活率。结果SS-d（1.0，2.0，3.0mg·L－1）明显改善肝细胞存活率，抑制乙醇引起的ALT活性的升高，对肝细胞中MDA含量升高和GSH-px活性降低均有明显的抑制作用。结论SS-d对乙醇损伤大鼠肝细胞有保护作用，其机制可能与SS-d清除自由基、抑制质脂过氧化作用有关。 【关键词】 乙醇 肝细胞 原代培养 柴胡皂苷-d 保护作用 机制 随着人们生活水平的提高和饮酒量的增加，酒精对肝脏的损害日渐突出。了解酒精对肝损伤的机制，筛选有效预防和治疗酒精性肝损伤的药物应用于临床，是亟待解决的重要课题。目前，中药复方对酒精性肝损伤的实验研究和报道比较多，单味制剂报道较少。柴胡皂苷（saikosaponins SS）是中药柴胡的有效成分，根据其化学结构不同可分为柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d等，以柴胡皂苷d(SS-d)药理活性作用最强。整体水平研究表明柴胡皂苷对酒精性肝损伤有预防作用［1］。本文建立体外乙醇损伤肝细胞模型，在细胞水平上进一步研究柴胡有效成分SS-d对乙醇损伤肝细胞的保护作用机制。 1 器材与方法 1.1 药品与试剂 SS-d（纯度98%），昆明长春花科技有限公司提供，临用前以蒸馏水配制；Hanks液高压灭菌,4℃保存；1.0 g·L－1胰蛋白酶，用Hanks液溶解，过滤除菌，调pH 7.2，分装，-30℃保存；基础培养液，RPMI1640培养基10.0 g，用超净水900 ml溶解，5.6%NaHCO3调pH至7.2，定溶到1 000 ml，过滤除菌，临用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 U·ml－1，链霉素100 μg·ml－1，胰岛素5 μg·ml－1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH-px测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。 1.2 动物 SD大鼠，2～4 d龄乳鼠，雌雄不限，清洁级，承德医学院实验动物管理中心提供。 1.3 仪器 CO2培养箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自动生化分析仪（美国Bayer公司），721W微机型分光光度计（上海光学仪器五厂），离心机（TGL.16G 上海）。 1.4 肝细胞分离培养［2］取新生2～4 d大鼠30只，75%乙醇浸洗后断头放血，无菌分离肝脏，去除肝脏外膜及其周围结缔组织，置Hanks液中，灌注冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的组织块，用Hanks冲洗数次，除去血细胞，加入0.8g·L－1胰蛋白酶10 ml,37℃孵育12 min，加入数滴血清终止消化，用滴管轻吹打成细胞悬液，经200尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，1 000 r离心5 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数gt;85%，按1 ×109个·L-1接种于铺有鼠尾胶原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2条件下培养24 h后更换培养液去除血细胞，继续培养72 h后进行分组实验。 1.5 乙醇诱导肝细胞损伤模型的建立将含肝细胞培养液的96孔板，设正常对照组及乙醇25，50，75，100 mmol ·L－14个剂量组，肝细胞悬液与不同浓度乙醇继续培养12 h，取培养液按赖氏法测定ALT活性，MTT法测定肝细胞存活率。 1．6 MTT法选择SS-d的实验浓度 SS-d初浓度为5 mg/L，采用细胞培养液进行稀释，依次为5.0 ，4.0，3.0 ，2.0 ，1.0 ，0.5 mg·L－1。将肝细胞接种于96孔板培养72 h更换培养液，换用SS-d稀释液培养，另设空白对照组，12 h后吸出培养液，各孔加入0.05%MTT200 μL，37℃孵育4 h，去上清液，各孔加入二甲基亚砜200 μl，混匀以溶解被还原的MTT结晶，检测波长为492 nm的光密度值，计算药物不同稀释浓度下细胞的存活率。 1.7 SS-d对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用取培养72 h肝细胞，设乙醇损伤模型组、SS-d(1 .0，2 .0，3.0mg·L－1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。模型组和SS-d组加入乙醇100 mmol·L－1，同时SS-d组加入不同浓度的SS-d，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养12 h，收集培养上清液检测ALT活性，收集肝细胞检测MDA含量和GSH-px的