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正交实验优选南山茶子总黄酮最佳提取工艺 　作者：林红景 吴小娟 唐 前 石海峰 唐玲 冯宝民 王永奇 【摘要】 目的优选南山茶子中总黄酮的提取工艺。方法采用乙醇-水法从南山茶子中提取总黄酮，利用正交实验优选总黄酮最佳提取工艺，考察乙醇浓度、时间、温度、浸提次数及料液比对总黄酮收率的影响。结果总黄酮的最佳提取工艺为：20倍量70%乙醇-水在80℃下提取两次，2.5 h/次，总黄酮的收率为3.42%，总黄酮含量为18.55%。结论醇水提取法可用于南山茶子中总黄酮的提取，其中料液比对总黄酮的提取影响较大。 【关键词】 南山茶种子 总黄酮 提取工艺 正交实验 南山茶为山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）植物，分布于广西的东南部至广东西南部，海拔250～500 m的山地，资源丰富。我们前期的实验研究推断南山茶种子中的黄酮类化合物为抗骨质疏松的有效成分，故本研究在单因素的基础上，以南山茶种子中总黄酮收率为指标，利用正交实验优化总黄酮的提取工艺。 1 仪器与试药 1.1 仪器Unico 7200可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）；Laborata4000型旋转蒸发仪（Heidolph公司）；BP210S十万分之一电子天平（Sartorius公司）；水浴锅HH4（国华电器有限公司）；真空干燥箱DZF6021型（上海精宏实验设备有限公司）；循环水工真空泵SHZD（巩义市英峪圣华仪器厂）。 1.2 试药南山茶种子Camellia semiserrata Chi.于200603采集于广西省平南县六陈镇，由中科院昆明植物所裴盛基教授鉴定；对照品（山奈酚3OβD葡萄糖基（6→1）2’’’， 4’’’O二乙酰基αL鼠李糖基（3→1）2’’’’， 3’’’’， 4’’’’O三乙酰基αL鼠李糖苷），由本实验室从南山茶种子中分离得到；所用试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 总黄酮的测定［1］ 2.1.1 标准曲线的绘制 精确称取干燥至恒重的对照品20 mg，置100 ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，得浓度为0.2 mg/ml的对照品溶液，备用。精密吸取对照品溶液 0.00，0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 ml，各加甲醇至4.0 ml，再分别加入质量分数为5%的NaNO2溶液0.3 ml，摇匀，室温放置6 min，再加10% AlCl3溶液0.3 ml，摇匀，室温放置10 min，在400 nm波长下测定吸光度A，同时以试剂空白做参比。以吸光度A为纵坐标，浓度C（mg/ml）为横坐标，绘制标准曲线。得到回归方程 A=15.065C+0.002 6，R2=0.999 9； 线性范围：0.013～0.065 2 mg/ml。 2.1.2 样品溶液的测定准确称取10.0 g南山茶种粕，粉碎，于500ml圆底烧瓶中，按实验设置的处理条件提取，在旋转蒸发仪上浓缩成膏状后于60℃真空干燥箱中干燥至恒重，准确称取干燥粉末20 mg用甲醇溶解，定容至10 ml容量瓶中，准确吸取一定量置于具塞试管中，照“2.1.1”项下自“各加甲醇至4.0ml”后同法测定吸光度。代入回归方程中计算总黄酮的含量，并计算总黄酮的收率〔总黄酮收率（%）=提取液中总黄酮质量/南山茶种粕质量×100%〕。 2.2 单因素实验［2］ 2.2.1 提取溶剂的浓度对总黄酮收率的影响在恒定浸提时间为2 h，浸提温度为100℃，提取次数为3次、料液比为1:10的条件下，分设60%，70%，80%，90%共4个提取浓度进行提取，计算南山茶种子中总黄酮的收率（见图1）。随着乙醇浓度的增加，总黄酮的收率增加，当乙醇浓度为70%时总黄酮的收率最高，但随着乙醇浓度的继续增加，总黄酮的收率明显降低，可能是由于70%乙醇水溶液对总黄酮溶解性能好﹑对原料的溶胀系数高的原因，故选提取溶剂为70%乙醇水。 　 图1 提取溶剂的浓度对总黄酮收率的影响 2.2.2 提取时间对总黄酮收率的影响在恒定浸提温度为100℃、提取次数为3次、料液比为1∶10，提取溶剂为70%乙醇水的条件下，分设1，2，3，，5 h共5个提取时间，计算总黄酮的收率（见图2），从图2可以看出，提取时间为2 h的时候总黄酮收率最高，随着提取时间的延长，总黄酮的收率有所下降，故选定2 h为最佳提取时间。 图2 提取时间对总黄酮收率的影响 图3 提取温度对总黄酮收率的影响 2.2.3 提取温度对总黄酮收率的影响在恒定提取时间为2 h，提取次数为3次、料液比为1∶10，提取溶剂为70%乙醇水的条件下，分设60，70，80，90，100℃5个温度点进行提取，计算总黄酮的收率（见图3）。由图3可知，总黄酮收率随提取温度的升高而增大，但温度高于90