激光共聚焦显微镜观察人胃癌细胞粘附过程及整合素β1表达.docVIP

激光共聚焦显微镜观察人胃癌细胞粘附过程及整合素β1表达 　 作者：徐远义 黄允宁 马竟先 【摘要】 ［目的］ 探讨胃癌细胞粘附过程中的形态学变化以及与整合素β1表达的关系。［方法］ 借助位相差显微镜和激光共聚焦显微镜对胃癌MKN1活体细胞的粘附过程和整合素β1的表达部位和程度进行观察。［结果］ 细胞通过伸出伪足附着在培养盘上，整合素β1在细胞膜和细胞伪足部分的表达增强，并形成集落团块。［结论］ 人胃癌MKN1细胞的粘附过程和整合素β1的表达有直接关系。 【关键词】 胃肿瘤 粘附 整合素β1 粘附是肿瘤细胞转移的一个基本过程。整合素是一个质膜糖蛋白的家族，由非共价结合的杂合二聚体组成，参与细胞—间质及细胞—细胞间粘附作用，包括胚胎发育、止血、血栓形成、创伤愈合、免疫性及非免疫性防御机制和致癌的转化作用等。整合素β1与肿瘤浸润有关。本实验使用共聚焦显微镜对胃癌MKN1细胞的粘附过程进行了观察，同时对整合素β1在粘附过程中的作用进行了研究。 1 材料与方法 1.1 主要材料 人胃癌MKN1细胞株购自日本癌研究资源库。细胞保存在含有10%小牛血清(FBS)的RPMI?鄄1640培养液中，在37℃，5%CO2的条件下培养。使用FITC标记的抗整合素β1抗体。 1.2 方 法 位相差显微镜观察：将MKN1细胞(5×104细胞/孔) 培养于4孔培养盘中30min后用位相差显微镜观察细胞的形态。 细胞整合素β1的荧光免疫染色：将MKN1细胞培养于含有FITC标记的抗整合素β1抗体（1/50）的0.2% 牛血清蛋白（BSA）/PBA中90min。用PBS洗3次后，将细胞置于共聚焦显微镜观察盒中，用含有10%FBS的培养液培养,在37℃，5%CO2条件下进行观察（激发波长488nm，发射波长515nm）。 2 结 果 2.1 胃癌MKN1细胞形态变化 胃癌MKN1细胞是贴壁生长细胞，在置入培养盘后很快附着在培养盘壁上，并粘附于培养盘上。细胞首先发生形态变化，由圆形变成椭圆形，同时伸出伪足与培养盘壁相接，使细胞稳定地粘附于培养盘壁上。细胞继续伸展成扁平状，并通过伪足与其它细胞接触形成单细胞层，这种结构可以使细胞稳定附着于培养盘上。培养30mim后位相差显微镜下即可观察到细胞与培养盘粘附；4h后可观察到细胞伸展呈扁平状，表面形成伪足，细胞伪足间相互连接，使细胞稳定附着于培养盘上。 2.2 整合素β1 整合素β1为跨膜蛋白，在细胞膜上表达。培养5min后即可观察到细胞表面形成毛刺状伪足(图1箭头所示)，在细胞膜上可观察到较弱的荧光信号，即整合素β1有微弱表达。培养2h后细胞变形并形成伪足，在细胞底面的细胞膜上和毛刺状伪足上可以观察到较强的荧光信号，表明整合素β1向细胞底面和细胞伪足聚集。培养4h后，细胞底面形成巨大伪足，在细胞伪足上可观察到强烈的荧光信号，整合素β1形成许多巨大的集落团块见图2。 3 讨 论 整合素是一种膜镶嵌糖蛋白，由18ix和813两个亚单位非共价形成异二聚体复合物。亚单位的变异使整合素形成一个庞大的家族，有的参与不同细胞之间的粘附连接，有的协助细胞和细胞外基质的结合。整合素通过胞外区与配体细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)结合，如纤黏连蛋白(fibronectin，FN)，玻黏蛋白(vitronectin，VN)等，个别的还能与可溶性的配体如纤维蛋白原(fibrinogen)和一些细胞表面分子结合，从而介导细胞与ECM 以及细胞与细胞之间的粘附[1]。它通过胞内区与细胞内的骨架蛋白、肌动蛋白、辅肌动蛋白、踝蛋白、纽蛋白等相互作用[3]。细胞经整合素介导与ECM粘附并在其上铺展，整合素在粘附面的分布呈斑点存在，细胞骨架蛋白以斑点为中心集中，在细胞膜的胞质面形成黏附斑[2]。由此，整合素将细胞外基质与细胞内骨架蛋白连接在一起，介导细胞与细胞及细胞与细胞外基质的粘附，维持细胞的形态，影响细胞的粘附、运动、吞噬等作用[3]。 　 肿瘤转移是一个复杂的多步骤多环节的过程，在肿瘤转移过程中发生许多肿瘤细胞和ECM的相互作用，整合素在此过程中发挥主要作用。当癌细胞发生转移时，它们与ECM的亲和力发生改变，这种表型改变通过细胞表面黏附分子整合素的改变、蛋白酶释放使ECM重塑及新的ECM分子沉积来调节[4]。这些激活的信号级联调节基因的表达、细胞骨架的形成、细胞粘附和细胞存活，结果使癌细胞更具侵袭性，在不同微环境中更好地生存[5]。在转移过程中，癌细胞伸出扁平伪足与ECM粘附，同时使ECM分子之间的联系消失，从而使癌细胞前行。 本研究通过光学显微镜和共聚焦显微镜观察到MKN1细胞移动时首先伸出伪足，然后细胞变形成为扁平状，细胞与细胞之间以伪足相连接，细胞通过其形态改变以及与其它细胞间的连