电针血清对β淀粉样蛋白损伤原代培养大鼠海马神经元效果探究.docVIP

电针血清对β淀粉样蛋白损伤原代培养大鼠海马神经元效果探究 　　阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）是最常见的中枢神经系统退行性变性疾病。其主要特征是记忆丧失、认知缺陷 　和严重的精神神经症状。beta;淀粉样蛋白（beta;-amyloid protein， Abeta;）是各种原因引发的AD的共同通路[1]，Abeta;级联学说是目前研究最多的AD的病理机制之一。临床和动物实验均表明，电针治疗对AD具有明显的疗效[2-3]，但其机制目前尚未完全阐明[4]。电针血清是指针灸处理后的动物血清，以其作为效应物质，通过观察培养细胞的形态和分子生物学改变，可从体外实验直接研究针灸的作用机理[5]。本实验从电针血清是否有效降低大鼠海马神经元凋亡的角度进一步探讨电针治疗保护海马神经元和增强学习记忆功能的作用机制。 　1 实验材料 　1.1 动物 　成年SPF级SD大鼠30只（动物合格证号：2008001611157），雄性，体质量350～450 g；出生24 h内SD大鼠20只（动物合格证号：2008001609451），均由上海中医药大学实验动物中心提供。常规饲养，昼夜时间比为1∶1。 　1.2 试剂与仪器 　Abeta;1-40、Abeta;25-35（Sigma公司）；TUNEL染色试剂盒、MTT试剂盒（碧云天生物技术研究所）；抗Caspase-3兔单克隆抗体（Santa cruz）；FITC-羊抗兔IgG（Santa cruz）；青霉素、链霉素粉针剂（华北制药集团）；微管相关蛋白2抗体（MAP-2）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购自美国cell signaling technology公司。 　Morris水迷宫实验系统（Smart Junior，西班牙Panlab公司），脑立体定位仪（中国人民解放军第二军医大学生理教研室），微量注射器（5 ?L，Hamilton，瑞士），G6805A型电针治疗仪（常州英迪电子医疗器械有限公司），孔径0.22 ?m过滤器（Millipore公司），无菌针灸针（0.25 mmtimes;13 mm，吴江市云龙医疗器械有限公司）。 　2 实验方法 　2.1 造模 　10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉后，将成年大鼠头颅固定在脑立体定位仪上，头皮备皮，消毒手术区皮肤，做正中切口暴露前囟，参照大鼠脑立体定位图谱，以前囟为原点，向后3.5 mm，旁开2.0 mm为钻孔点，钻开对称2个孔，自脑表面进针3.0 mm至海马，用微量进样器抽取2 ?L Abeta;1-40（用无菌生理盐水将其稀释成10 ?g/?L，37℃孵育1周，使其变为聚集状态），缓慢进针，注射速度0.2 ?L/min，注射完毕，停针5 min后，以1.0 mm/min速度缓慢拔针，缝合皮肤，术后肌肉注射青霉素，连续3 d，以防感染。 　2.2 分组与治疗 　实验分为正常组、模型组和电针组。对照大鼠穴位图谱，以13 mm毫针针灸“百会”（顶骨正中）、“肾俞”（第2腰椎下两旁），连接G6805A型电针治疗仪，选择连续波，频率为20 Hz。针刺治疗每日1次，每次30 min，1周为1个疗程，治疗4个疗程。正常组及模型组正常饲养，不予针刺治疗。在治疗结束后，各组分别在无菌条件下，下腔静脉采血，分离血清，过滤除菌，冰冻保存备用。 　2.3 原代海马神经元的培养 　出生24 h内SD大鼠，断头取脑，分离出双侧海马组织，消化，吹打后以1times;106/mL的密度接种于培养板内。细胞培养7 d后，将其分为正常组、模型组和电针血清组，各组分别更换含有“2.2”项中各组10%血清的培养液，模型组和电针血清组予以 Abeta;25-35（26 ?L/mL）处理48 h。 　2.4 MTT法检测细胞增殖 　用5 mL MTT溶剂溶解25 mg MTT，配制成5 mg/mL MTT溶液。设置调零孔，每孔加入10 ?L MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4 h，使其充分形成紫色结晶。每孔直接加入100 ?L Formanzan溶解液，在细胞培养箱内继续孵育，直至在普通光学显微镜下观察发现 Formazan全部溶解。在570 nm波长测定吸光度（OD值）。 　2.5 免疫组织化学染色 　TUNEL染色：取出细胞培养板，免疫染色固定液固定细胞30 min，0.01 mol/L PBS洗涤1次，免疫染色洗涤液清洗1次， 0.01 mol/L PBS洗涤2次，在样品上加50 ?L TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min。PBS洗涤3次，抗荧光淬灭封片液封片后于荧光显微镜下观察并拍照。 　Caspase-3免疫细胞化学染色：取出细胞培养板，免疫染色固定