白介素12重组腺病毒载体构建及其抗肿瘤作用初步观察.docVIP

白介素12重组腺病毒载体构建及其抗肿瘤作用初步观察 　 作者：鞠全荣　黄丽华　张孝卫　杜德田　耿秀兰　刘宗印　马力　张如胜　任东俊 【摘要】 　　［目的］ 构建携带小鼠白细胞介素12腺病毒载体（AdCMVmIL,12），并观察其对H22肿瘤的抑瘤效果。［方法］ 构建重组质粒pdlE1SP1BmIL,12，并用该质粒与质粒pJM17共转染293细胞后包装而成AdCMVmIL,12，并进行酶切法鉴定。同时制备肿瘤动物，通过肿瘤内局部注射AdCMVmIL,12，观察其抗肿瘤作用。［结果］ 酶切鉴定显示构建正确，其病毒滴度为1.3×109pfu/ml；当病毒滴度为100MOI时，mIL,12浓度达到3 417ng/1×106细胞/24h。动物实验表明，注射AdCMVmIL,12的小鼠，肿瘤体积明显小于对照组（Plt;0.01），生存期显著延长。［结论］构建AdCMVmIL,12成功，肿瘤内局部注射可发挥抗肿瘤作用。 【关键词】 白细胞介素12　重组腺病毒　基因表达　肿瘤　小鼠 　　1 材料与方法 1.1 材料与试剂 菌株、细胞株和质粒：大肠杆菌DH5α，质粒pCDNA/amp/mIL,12/p35，pCDNA/amp/mIL,12/p40，pCA13，pdlE1SP1B，pJM17，大鼠髓质甲状腺癌细胞（rMTC）由美国芝加哥大学提供；人胚肾293细胞由第二军医大学提供；T4 DNA连接酶（Invitrogen），限制性内切酶HindⅢ,Xhol,EcoRⅤ，BglⅡ (TaKaRa)，RNA酶抑制剂（北京华美公司）；昆明种小鼠购自山东大学动物中心，许可证号为SCXY（鲁H22由本室保存。 1.2 方 法 1.2.1 质粒制备 用感受态大肠杆菌DH5α常规方法扩增质粒 pCDNA/amp/mIL,12/p35、pCDNA/amp/mIL,12/p40、pCA13、pdlE1SP1B、pJM17。 AdCMVmIL,12的构建：用HindⅢ、Xhol酶切pCDNA/amp/mIL,12/p40，并将其插入HindⅢ、Xhol酶切后的pCA13中，获得pCA13mIL,12/p40；同法用HindⅢ 和EcoRⅤ酶切pCDNA/amp/mIL,12/p35，并将其插入HindⅢ、EcoRⅤ酶切后的pCA13中，获得pCA13mIL,12/p35；将Bgl Ⅱ酶切pCA13mIL,12/p40并补平粘端所得小片段与EcoR1酶切pdlE1SP1B并补平粘端所得大片段通过T4 DNA连接酶连接，得到pdlE1SP1BmIL,12/p40；将Bgl Ⅱ酶切pdlE1SP1BmIL,12/p40所得大片段和Bgl Ⅱ酶切pCA13mIL,12/p35所得小片段连接，得到pdlE1SP1BmIL,12。重组的pdlE1SP1BmIL,12/p40/p35分别含有两个CMV启动子和两个SV40终止信号。用pdlE1SP1B mIL,12转染293细胞，包装并扩增出AdCMVmIL,12。 包装过程：在1ml无血清培养基中加入5μl脂质体（LIPOFECTAMINE）、8μg pJM17及4μg pE1SP1BmIL,12，上述混合液室温放置15min。弃去细胞培养液，用无血清DMEM培养基洗两遍，加入上述混合液，置37℃的CO2培养箱中孵育3~4h，再加入含20% 胎牛血清的DMEM，CO2培养箱中37℃培养。第二天将细胞分至3个培养皿，继续培养，隔天补充0.5ml含10% 胎牛血清的DMEM，注意观察细胞病变效应（CPE）的出现。包装好的腺病毒为AdCMVmIL,12。转染前正常293细胞呈梭状，连接成片。转染后293细胞固缩成团、部分细胞裂解。 1.2.2 对重组腺病毒鉴定 用限制性内切酶HindⅢ和Xhol对重组腺病毒DNA进行常规酶切鉴定。 1.2.3 重组腺病毒的扩增和滴度测定 取经酶切鉴定正确的AdCMVmIL,12感染293细胞，大量扩增AdCMVmIL,12。将扩增后的病毒液做倍比稀释，在96孔板上感染293细胞进行病毒滴定，观察每孔中的细胞病变效应（CPE）。以出现CPE的最高稀释度为病毒滴度。 　 1.2.4 AdCMVmIL,12的生物学活性检测 取1×106大鼠髓质甲状腺癌细胞（rMTC），用500μl滴度为100MOI（感染复数）的AdCMVmIL,12感染1h，被感染的细胞经过无血清培养基洗3遍后在96孔板上培养。24h后收集上清（内含mIL,12）待检测。同时用重组mIL,12作为阳性对照，用含有荧光素基因重组腺病毒（AdCMVLuc）感染后的rMTC培养上清作阴性对照。 1.2.5 AdCMVmIL,12抑瘤性实验 注射1×106个H22细胞于昆明种小鼠皮下，并在长成的