白刺总黄酮对血管内皮细胞损伤保护作用探究.docVIP

白刺总黄酮对血管内皮细胞损伤保护作用探究 　 作者：张义军 樊莲莲 张永军 李连疆 邓峰美 唐克 韩荣 【摘要】 目的研究白刺总黄酮对血管内皮细胞损伤的保护作用及机制。方法用过氧化氢（H2O2）诱导血管内皮细胞损伤,用酶标仪检测细胞内一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）以评价氧化的程度。结果不同浓度的白刺总黄酮可促进受损的内皮细胞修复，同时提高SOD、NOS、GSH-Px活力和NO水平。结论白刺总黄酮具有保护血管内皮细胞损伤的作用，其机制可能与其抗氧化作用有关。 【关键词】 白刺总黄酮 内皮细胞 过氧化氢 抗氧化 白刺为我国的特有种，在新疆干旱地区分布广泛，其果实中含有丰富的营养成分和活性物质，可入药，具有调经活血，消食健脾等功效。课题组对白刺总黄酮进行分离发现含有槲皮素、山萘酚、异鼠李素等黄酮单体化合物，它们都具有一定的抗氧化能力［1～3］。总黄酮与其单体化合物进行对比抗氧化能力强弱尚未见报道。内皮细胞损伤直接或间接的反应氧化程度，同时内皮细胞损伤是动脉硬化发生的始动环节［4］。因此本实验利用体外细胞培养方法，用H2O2诱导HUVEC损伤，槲皮素做阳性对照，研究白刺总黄酮对HUVEC损伤的保护作用及可能机制。 　　1 材料 　　0.1%Ⅰ型胶原酶(武汉博士德生物工程有限公司)；PBS（Phosphate Buffered Saline）;缓冲液(JMF-0006天津津脉) ;胎牛血清(CHARACTERIZED公司) ;SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所,批;GSH-Px试剂盒(南京建成生物工程研究所,批; NO试剂盒(南京建成生物工程研究所,批); NOS 试剂盒(南京建成生物工程研究所,批); TDL-5000低温冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂); PufferHubbard超低温冰箱(美国HARRIS公司);XW -80A旋涡混合器(上海精科实验有限公司);电热恒温水浴锅(北京泰克仪器有限公司);超净台(ZHJH-1112B苏州公司) ；CO2 孵箱(Thermo Formo公司) ； 双向磁力搅拌器(79-2 江苏金坛市医疗仪器厂)；电子分析天平(AE-200 上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；倒置相差显微镜(BDS200-PH奥特光学 OPTEC)； 酶标仪(SN-3001 Thermo Formo公司)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9240 上海齐欣科学仪器有限公司)；立式电热压力蒸气灭菌器(LDZX-30FBS 上海申安医疗器械厂)。 　　2 方法 　　2.1 白刺总黄酮的制备取白刺果，75%乙醇进行连续回流提取4次，每次加75%乙醇7倍量回流2 h，分别过滤浓缩至浓膏无醇味，用2.5％碳酸钠(pH8)溶解浓膏,过滤；过滤液用50%盐酸调至pH为5,过滤得沉淀用水洗至中性，烘干。利用聚酰胺柱层析分离得白刺总黄酮。对其用Sephadex LH-20进行分离纯化得槲皮素［5］。 　　2.2 HUVEC的培养及分组 HUVEC的原代培养:按文献［6］报道以及在实验中的摸索对方法行进了改进。2007-10～2008-04,在我院妇产科产婴室收集健康胎儿脐带20～40 cm,用0.1%胶原蛋白酶得到人胎儿脐静脉内皮细胞。培养于ECM培养液中,置于37℃下5%CO2培养箱中。进行培养传到第3代用于试验。实验分正常对照组、阳性对照组（加75μmol/L H2O2＋槲皮素80 μmol/L）、模型组(仅加75μmol/L H2O2)和白刺总黄酮低、中、高3个剂量组(均加75 μmol/L H2O2及分别加20 μmol/L白刺总黄酮、40 μmol/L白刺总黄酮、80μmol/L白刺总黄酮),每组6例。 　　将2×104个/孔HUVEC接种6孔板,在上述条件下孵育24 h，分别加入上述浓度的槲皮素和白刺总黄酮，各组细胞孵育24 h，然后除正常对照组外加入75μmol/L H2O2诱导损伤，继续培养4 h后终止培养，进行有关指标的测定。 　　2.3 检测方法NO，NOS，SOD，GSH-Px的具体测定方法参照试剂盒说明书进行。 　　3 结果 　　3.1 白刺总黄酮对受损内皮细胞NO含量和总型NOS、结构型NOS活力的影响NO不仅能调节血管舒张，还是一种重要的抗炎分子,NO减少可以加速内皮细胞损伤［7］。从测定数据显示，模型组与正常对照组比较有显著性差异（Plt;0.01），表明H2O2诱导内皮细胞受损模型复制成功；从各组的NO水平可看出模型组比阳性对照组有明显降低（Plt;0.05），不同剂量的总黄酮组随着浓度的升高NO的浓度也升高，与相同剂量的阳性对照组比虽没有统计学意义