磁性纳米四氧化三铁及纳米金协同柔红霉素作用于K562-A02细胞初.docVIP

磁性纳米四氧化三铁及纳米金协同柔红霉素作用于K562/A02细胞初 　 作者：戴永援，陈宝安，王雪梅，张仁云，高峰，丁家华，高冲，孙耘玉，程坚，赵刚，王骏 【摘要】 目的:研究磁性纳米四氧化三铁（NanoFe3O4）及纳米金（NanoAu）是否具有逆转K562/A02细胞耐药的作用。方法：用MTT法测定盐酸柔红霉素（DNR）对K562/A02和K562细胞的毒性，并观察DNR与NanoFe3O4或NanoAu的联合作用。结果：体积分数为25%的NanoFe3O4及NanoAu能有效增强DNR的细胞毒作用，提高细胞的凋亡率，差异具有显著性。结论：NanoFe3O4及NanoAu结合DNR后均能有效逆转K562/A02细胞的耐药性。 【关键词】 磁性纳米四氧化三铁；纳米金；柔红霉素；多药耐药；K562/A02细胞 　盐酸柔红霉素（daunomycin，DNR）属蒽环类抗肿瘤药，是一种目前广泛应用于血液系统肿瘤和各种实体瘤的化疗药。DNR等细胞毒性药物在杀伤肿瘤细胞的同时也产生了严重的药物副作用，加大药物剂量能相应提升局部药物浓度而提高药物疗效，但也将增加全身的毒副作用。另外，在化疗过程中很多肿瘤细胞能对化疗药物产生耐受而降低疗效，多药耐药(multidrug resistance，MDR)已成为肿瘤患者化疗最终失败的主要原因。寻求各种能有效提高局部药物浓度的途径是肿瘤治疗领域研究的热点之一。传统的MDR逆转剂有钙拮抗剂、环孢菌素类、激素及抗激素类化合物、蛋白激酶抑制剂、氨基哌啶衍生物S9788等[1]。逆转剂的应用虽然是解决MDR的一种常用方法,但因其毒性较强、副作用较大而影响它在临床的广泛应用，因此，借助某些药物载体系统，减少药物用量，实现药物的靶向给药将是颇有意义的新途径。近年来纳米载体逆转肿瘤细胞MDR已受到越来越多的关注，磁性纳米四氧化三铁（NanoFe3O4）是一种磁性强、制备相对简单而且生物相容性较好的磁性材料，是生物医学领域常采用的磁性载体材料[2]。本实验研究了NanoFe3O4及纳米金（NanoAu）对K562/A02细胞MDR的逆转效果。 　　1 材料和方法 　　1.1 细胞系和培养条件K562/A02细胞是经阿霉素逐步诱导、具有MDR表型的稳定细胞系，由中国医学科学院血液学研究所杨纯正教授、齐静老师提供。K562/A02细胞维持增殖的阿霉素终浓度为1mg·L-1，实验前无药培养2周。K562敏感细胞系由作者所在实验室保存。接种于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中，2～3 d传代1次。 　　1.2 实验仪器、药物及试剂LDZ52离心机（北京医用离心机厂），Sartorius BS110S天平（北京赛多利斯天平有限公司），HZ8201K 恒温振荡器（太仓市科教器材厂），DNR（Farmitalia公司），RPMI 1640培养基、小牛血清（Gibco公司），噻唑蓝（MTT，Sigma公司），Model 550酶标仪（日本BIORAD公司），FACSCALIBUR流式细胞仪（美国BD公司），NanoFe3O4及NanoAu由东南大学生物科学与医学工程学院提供，在使用前将纳米粉粒用灭菌水溶解，超声混匀，制备成饱和溶液。 　 　　1.3 方法 　　1.3.1 MTT法 取处于对数生长期的K562/A02和K562细胞，调整浓度为12×104 ml-1，分别加入浓度为50、25mg·L-1的DNR，倍比稀释6个浓度，测定DNR对此两种细胞的生长抑制曲线，同样测定NanoFe3O4及NanoAu对此两种细胞的生长抑制曲线，对DNR和两种纳米材料进行多种浓度的组合，选取抑制效果最明显的组合作为药物干预浓度。每个浓度设3个复孔，另设细胞对照组。以每孔200μl接种到96孔培养板，置37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h，每孔加入5g·L-1 MTT 20μl，继续培养4 h，弃去各孔内的液体，每孔加入DMSO 150μl，振荡10 min后在酶标仪540 nm处测定吸光度(A)值，并按下列公式计算不同浓度细胞生长抑制率。 生长抑制率（%）=(1-实验孔A值/对照孔A值)×100%。 　　1.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡及细胞内DNR浓度 根据蒽环类药物自发荧光的特性(DNR在488 nm的激发光下发红光)检测细胞内DNR浓度。取对数生长期的K562/A02细胞，按处理条件分为：A组，空白对照组；B组，DNR组；C组，DNR加NanoFe3O4组；D组，DNR加NanoAu组。48 h后收获细胞，冷PBS洗涤2次，1 ml PBS重悬后上样。1.4 统计学处理MTT和流式细胞术测定数据的统计处理采用统计软件SPSS 11.5，显著性检