神经营养素受体p75NTR在不同胎龄人胎脑海马中表达.docVIP

神经营养素受体p75NTR在不同胎龄人胎脑海马中表达 　 作者：王伴青，胡煜辉，廖义林，彭建安，温永顺 【关键词】 神经营养素受体；海马；人胎脑 　　【关键词】 神经营养素受体；海马；人胎脑 0引言 　　神经营养素是一个高度保守的生长因子家族,包括两种受体: 低亲和力的神经营养素受体p75 (p75 neurotrophin receptor, p75NTR)和高亲和力的Trk. p75NTR是一种Mr为75 000的I型膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRⅠ）的成员. 在不同的条件下p75NTR发挥完全不同的生物学效应，一方面它与Trk共表达时，二者结合成杂合二聚体，形成神经营养因子的高亲和性受体，促进神经细胞的存活与生长；另一方面，当p75NTR单独表达时，它能以相同的亲和力与所有的神经营养因子结合而诱导细胞凋亡［1-2］. 海马属边缘系统，与学习记忆、情绪、行为及内脏活动密切相关，在胚胎海马的发育过程中，神经细胞的增殖、分化和凋亡活动非常活跃. 我们通过研究p75NTR在胚胎海马发育过程中的表达及其变化规律,探讨了p75NTR对神经元发育的影响. 1材料和方法 1.1材料收集临床水囊引产胎儿45例(性别不限), 按末次月经时间结合测量顶臀长（Patten法［3］）推算胎龄，按胎龄分成13～16 wk（n=10）、17～20 wk（n=12）、21～24 wk（n=9）、25～28 wk（n=8）、29～32 wk（n=6） 5组. 每例水囊引产胎儿均无神经系统畸形，其母亲均查体健康，由井冈山学院附属医院和吉安市第一人民医院妇产科经胎儿母亲及家属签字同意后提供. 鼠抗人p75NTR mAb为美国Santa Cruz公司产品，ＳＰ免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购于北京中山生物试剂公司. 1.2方法 1.2.1取材、固定及切片水囊引产胎儿娩出后( 均已死亡) 2～3 h内开胸经左心室先以生理盐水灌注冲洗干净后,再以40 g/L多聚甲醛液/0.1 mol磷酸缓冲液灌注固定4 h, 打开头皮及颅骨,撕除脑表面之被膜, 切取海马组织,相同固定液后固定1 wk，经700～1000 mL/L上行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋, 连续切片，切片厚度为8 μｍ,贴于涂有多聚赖氨酸胶的清洁玻璃片上烤干待用. 1.2.2免疫组化染色(ＳＰ法)采用mAb链菌素亲生物蛋白过氧化物酶(ＳＰ)免疫组化法. 石蜡切片经常规脱蜡后, 清水冲洗，滴加30 g/L过氧化酶阻断剂50 μL,室温30 min,清水冲洗; 0.01 mol/L ＰＢS洗5 min×3次;加10 g/L正常山羊血清50 μL,室温下孵育30 min,吸去多余液体;5组分别滴加鼠抗人p75 mAb（1∶100）（Santa Cruz,USA） 50 μL,4℃的冰箱过夜, 0.01 mol/L ＰＢS洗5 min×3次；加生物素标记二抗（1∶200） 50 μL,室温下1 h， 0.01 mol/LＰＢS洗5 min×3次；加ＳＰ溶液50 μL,室温下1 h，0.01 mol/L ＰＢS洗5 min×3次;加DAB液100 μL,显色5 min后双蒸水冲洗中止反应,脱水、透明、中性树脂封片,光镜下观察. 用0.01 mol/L ＰＢS代替一抗作对照实验，结果为阴性. 1.2.3图像分析每组每例取3张切片，每张切片在光镜(×400)下阳性细胞分布均匀的部位随机各取5～10个视野,图像经摄像仪输入电子计算机,经HMIAS2000高清晰度彩色医学图文分析系统细胞测量程序处理,计算出每组阳性细胞数和总细胞数，再计算出每组样本的阳性细胞百分率. 统计学处理: 采用SPSS 10.0统计软件中R×C表资料的χ2检验比较组间p75NTR阳性细胞百分率，Plt;0.05认为有统计学意义. 2结果 2.1p75NTR的表达与分布在光学显微镜下观察p75NTR免疫反应阳性产物为棕黄色颗粒，主要定位于细胞质内，部分胞核淡染. 在不同胎龄的切片均可见p75NTR免疫反应阳性细胞. 由于在16 wk前胎儿海马内的神经细胞体积小而圆，细胞核大，胞质少，p75NTR免疫反应产物范围小，部分结构阳性细胞计数较困难. 在胚胎13～16 wk，海马CA1,CA2,CA3区锥体细胞层内均可见分布着大量小而密集的强染或中等度染色的圆形p75NTR阳性细胞（图1A），随着胎龄的增加，细胞形态由小而圆逐渐变为锥体形. 在紧靠锥体细胞层浅表面的辐射层内也可见排列许多胞体较大、形态与锥体细胞类似、排列松散的p75NTR阳性细胞，并且呈现明显的神经毡染色（图1B）. 17 wk之后的海马齿状回已清晰可辨，可见大量密集排列的阳性颗粒细胞，CA1,CA2及CA3区的阳性锥体细胞密度随胎龄增长而逐渐降低