稳定表达猪瘟病毒E2蛋白细胞系建立及其生物活性分析.docVIP

稳定表达猪瘟病毒E2蛋白细胞系建立及其生物活性分析 　【摘要】 目的: 建立一种能稳定表达猪瘟E2蛋白的真核细胞系, 并对E2蛋白的生物活性进行分析。方法: 从实验感染兔脾组织中提取总RNA, 应用RTPCR得到了CSFV C株结构蛋白基因E2, 并在目的片段的5′端引入Kozak序列(Kozak, 1987), 定向克隆于逆转录病毒载体pBABE puro。经PCR、 酶切和序列分析鉴定, 获得阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载体pVSVG共转染GP2293细胞, 收获假型病毒, 在Polybrene的介导下感染PK15细胞, 嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。通过细胞传代并结合PCR、 免疫荧光及ELISA方法对表达蛋白的生物活性进行分析。结果: 初步检测显示所建立的PK15E2细胞能稳定携带外源基因进行传代, 而且表达的E2蛋白能被CSF阳性血清所识别, 并具有良好的生物活性。结论: 通过该方法建立的真核表达系统是切实可行的, 能为猪瘟的预防和诊断奠定良好的基础。 【关键词】 猪瘟C株E2基因; 重组逆转录病毒载体 PK15细胞 基因表达 　　猪瘟(classical swine fever, CSF)是猪的一种高度接触性传染病, 急性猪瘟死亡率几乎接近100%［1］, 被国际兽医局列为A类传染病。预防CSF感染的常规方法是免疫接种弱毒疫苗, 该苗曾对CSF防制作出巨大贡献, 但弱毒疫苗存着毒力返强的潜在危险, 并且无法区分自然感染和疫苗免疫, 这给猪瘟诊断带来一定的麻烦。解决这一问题急需一种抗原量高、 安全性好并且能够以此建立鉴别诊断的新型疫苗。鉴于此, 我们选用猪瘟E2基因为主要的免疫源基因, 定向克隆于逆转录病毒载体pBABE puro, 该重组质粒与pVSVG共转染包装细胞GP2293, 形成高滴度的假型病毒, 在polybrene的作用下感染PK15细胞, 成功地将E2基因整合到该细胞的基因组内。经多种方法鉴定表明E2基因能稳定地存在于PK15细胞, 并得到高效表达, 为进一步开发诊断试剂及亚单位疫苗奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 CSFV C株脾淋毒采用中国农科院兰州兽医研究所保存的种毒(中国兽药监察所的兔脾淋组织毒第480代), 于3～4月龄兔体中复壮和增殖, 无菌采集产生定型热兔脾, -76℃保存。逆转录病毒载体pBABE puro、 水疱性口炎病毒载体(pVSVG)、 PK15细胞及GP2293由中国农业科学院兰州兽医研究所病毒病研究室保存; 限制性内切酶EcoR I、 BamH I、 Sal I、 Hind III均购自Promega公司; 碱性磷酸酶(SAP)和DNA连接试剂盒、 大肠杆菌JM109购自大连宝生物有限公司; 聚乙二醇(PEG800)购自美国BBI公司; DNA回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自上海生物工程有限公司; 琼脂糖购自美国Biowest公司; 转染试剂采用Invitrogen公司LipofectamineTM 2000转染试剂盒; 细胞培养基及优等胎牛血清购自Hyclone公司; 猪瘟荧光素FITC标记抗体工作液购自中国兽药监察所; 猪瘟病毒抗原检测采用IDEXX公司的Classical Swine Fever Virus Antigen Test Kit; 细胞DNA提取采用Ugene公司的组织DNA提取试剂盒(Tissue DNA Kit); 其他试剂均为国产分析纯级产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 设计与合成 以GenBank中CSFV C株序列为参考, 借助DNAStar软件设计合成两条引物, E2f: 5′aaGGATCCaccATG gga cag atc gtg caa ggt gtg3′; E2r: 5′atGAATTC gtc cct ggg ctc ata gta3′。引物的5′端引入了保护碱基、 BamH I酶切位点、 符合Kozak规则的序列和起始密码子ATG; 下游引物中引入了EcoR I位点。该引物由大连宝生物工程有限公司合成。 　　1.2.2 逆转录病毒载体的构建 参照文献［2］, 采用RTPCR技术从试验感染兔脾组织中获得了C株E2基因, 其中扩增程序为: 96℃ 2 min, 94℃ 2 min, 58℃ 1 min, 72℃ 1 min 20 s, 循环35次后, 72℃延伸10 min。10 g/L琼脂糖电泳回收PCR产物。EcoR I, BamH I分别双切PCR产物及载体pBABE puro, 回收目的片段连接、 转化, 将鉴定为阳性的质粒命名为pBABE puroE2。 　　1.2.3 细胞培养方法 GP2293细胞培