窄谱中波紫外线对角质形成细胞肝素结合表皮生长因子样生长因子mR.docVIP

窄谱中波紫外线对角质形成细胞肝素结合表皮生长因子样生长因子mR 　 作者：罗素菊，彭振辉，郑焱，张路坤，王国荣，徐浩翔 【摘要】 目的 研究窄谱中波紫外线(NBUVB)对培养的正常人角质形成细胞(KC)增殖和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HBEGF)mRNA表达的影响。方法 用50mJ/cm2和100mJ/cm2 NBUVB照射正常人KC后继续培养12h，用MTT法和实时荧光定量RTPCR法分别检测KC增殖和HBEGF mRNA的改变。结果 NBUVB照射正常人KC后,可剂量依赖抑制KC的增殖和上调HBEGF mRNA的表达。50mJ/cm2和100mJ/cm2 NBUVB照射后，分别使KC增殖抑制5.4%和8.7%，使HBEGF mRNA增加到正常对照组的1.7倍和2.5倍。结论 NBUVB抑制KC的增殖部分是通过上调HBEGF的表达介导的。 【关键词】 表皮生长因子；角质形成细胞；窄谱中波紫外线 在亚热带中银屑病少见，并且银屑病有冬重夏轻的特点。这种现象提示温度和日光可能与银屑病的发病有关。自20世纪70年代，临床开始应用补骨脂素长波紫外线(psoralens plus ultraviolet A, PUVA)治疗银屑病、白癜风等皮肤科疾病，之后用中波紫外线(ultraviolet B, UVB)代替UVA。研究发现310nm左右的紫外线对银屑病的治疗效果最佳，红斑效应相对较小。因此，滤除其他波长紫外线所产生的波长在311nm左右的窄谱中波紫外线(narrowband UVB, NBUVB)得以产生并广泛应用于皮肤病的治疗。已证明NBUVB在银屑病的治疗中比普通UVB疗效更好，相同累积剂量下副作用也较小[1]。当前NBUVB光疗已广泛应用于银屑病的治疗，疗效肯定，但其治疗机制尚不完全清楚。 肝素结合表皮生长因子样生长因子(heparinbinding epidermalgrowthfactorlike growth factor, HBEGF)与转化生长因子α(transforming growth factorsα, TGFα)、双向调节因子和表皮调节素等生长因子相互作用，通过旁分泌形式调节角质形成细胞(keratinocyte, KC)的增殖和分化。HBEGF先以跨膜形式(proHBEGF)合成，其外功能区脱落后形成游离形式(sHBEGF)的HBEGF。proHBEGF可抑制细胞的生长，而sHBEGF 是KC、纤维母细胞、平滑肌细胞等多种细胞的有丝分裂原。在表皮增生性皮肤病如银屑病、基底细胞癌、鳞状细胞癌中，HBEGF的表达升高[24]。HBEGF在KC生长和分化的调节中发挥重要的作用。因此，我们在体外用不同剂量的NBUVB照射培养的正常人KC，检测其对细胞增殖和HBEGF mRNA表达的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要仪器和试剂 　　KC无血清培养基(KCSFM)、低糖DMEM、 Dispase酶均购于Gibco公司，依曲替酸(重庆华邦公司)，TRIzol试剂(Invitrogen公司)，RTPCR试剂盒(MBI公司)，SYBR green 2×PCR master mix(ABI公司)，PCR配套试剂(TaKaRa公司)，NBUVB光源(Waldmann, 德国)，Centrifuge 5417R高速低温离心机(Brinkmann Instruments Inc)，GeneAmp PCR system 9700(ABI公司)、PRISM 7900 sequence detector(ABI公司)。 　　1.2 原代KC的培养 　　取健康人环切术后包皮，消毒液浸泡后，置于2.5g/L Dispase酶4℃消化过夜，次日分离表、真皮，将表皮置于2.5g/L胰酶与0.02g/L EDTA(1∶1)混合液中，消化10min，用含100mL/L胎牛血清的DMEM终止消化，吹打后，100目筛网过滤，离心收集细胞，加入KCSFM，吹打后接种入培养瓶，于37℃、50mL/L CO2条件下培养，次日更换新培养基，以后每3d换液一次，当细胞70%-80%融合时传代，取3-5代细胞进行实验[5]。将实验细胞传代入6孔板中，当细胞90%融合时，用PBS冲洗后，覆盖薄层PBS，然后用50mJ/cm2和100mJ/cm2 NBUVB垂直照射KC，照射后换新培养液，继续培养12h，每组设3个孔，并设置未照射的正常对照组。 　　1.3 MTT 　　将处于对数生长期的细胞接种于96孔培养板，用50mJ/cm2和100mJ/cm2 NBUVB垂直照射，继续培养12h。设正常对照组和空白对照组(只加细胞培养液无细胞)。吸出培养液，每孔中加入MTT(5g/L