糖基化终产物对大鼠血管平滑肌细胞骨保护素mRNA表达影响.docVIP

糖基化终产物对大鼠血管平滑肌细胞骨保护素mRNA表达影响 　 作者：郭秀芳，任晓妹，魏芹，刘乃丰 【摘要】 目的：研究糖基化终产物(AGEs)对大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）骨保护素（OPG）mRNA表达的影响。方法：体外培养VSMCs，在含10mmol·L－1β-甘油磷酸(β-GP)的培养液中加入不同浓度(0、50、100、200、400mg·L－1)的AGE-牛血清白蛋白(BSA)与VSMCs 孵育不同时间(0、12、24、36、48、72h)。采用RT-PCR检测OPG的mRNA表达水平。结果：AGE-BSA呈时间和剂量依赖性地增加VSMCsOPGmRNA的表达；200mg·L－1的AGE-BSA与VSMCs孵育24h，OPGmRNA表达水平达到高峰。结论：AGE-BSA能够促进大鼠VSMCsOPGmRNA的表达。 【关键词】 糖基化终产物； 血管平滑肌细胞； 钙化； 骨保护素； 大鼠 心血管疾病是糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者主要致死致残的原因，血管钙化是其病理生理基础［1］，是预测DM患者心血管事件的最适宜指标［2］。蛋白质非酶糖基化形成的糖基化终产物(advanced glycosylation end products,AGEs)在介导高血糖致DM心血管疾病的过程中发挥着重要作用［3］。近来研究显示，骨保护素（osteoprotegerin,OPG）已经成为目前骨代谢和动脉钙化领域的重大发现和新课题。OPG的检测可能作为血管钙化早期诊断的指标之一［4］。本实验观察AGEs对培养的大鼠血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）钙化的影响，以探讨血管钙化发生的机制。 1 材料和方法 1.1 材料 牛血清白蛋白( bovine serum albumin,BSA)为BM公司产品，D-葡萄糖(分析纯)为重庆北培化学试剂厂产品，SD大鼠购自东南大学医学院实验动物中心，VSMCs为SD大鼠原代培养所得，培养基DMEM、HEPES为GIBCO公司产品，胎牛血清为Hyclone公司产品，TRIZOL为Invitrogen公司产品，RT-PCR试剂盒(Rever-tAidTM First Strand cDNA Synthesis)购自TaKaRa公司，DNA Marker(100、200、300、400、500、600bp)购自上海申能博彩公司，OPG及3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物由上海生工生物工程公司合成，琼脂糖(电泳级)购自MDBio公司，β-甘油磷酸(β-glycerophosphate,β-GP)购自Sigma公司。CO2恒温培养箱购自Hale Force公司，基因扩增仪购自Eppendorf公司，SCR-300电泳仪购自上海万达生物工程公司，GelDoc-Itimaging system扫描分析仪为UVP公司产品。 1.2 方法 1.2.1 AGE-BSA的制备 参照文献［5］，将葡萄糖用0.02mol·L－1PBS溶液(pH7.4)配成0.5mol·L－1溶液,加入BSA(浓度为5.0g·L－1),过滤除菌,37℃孵育3个月,用PBS溶液透析除去未结合的葡萄糖。作为对照的BSA组(浓度为5.0g·L－1)除不加葡萄糖外,按上述条件处理。荧光光谱扫描(激发波长370nm、发射波长440nm、狭缝3nm)测定AGE-BSA荧光值。 1.2.2 大鼠VSMCs的培养 贴块法培养VSMCs。基础培养基为含20%胎牛血清、2mmol·L－1谷氨酰胺、100U·ml－1青霉素、100μg·ml－1链霉素的DMEM培养液。待VSMCs生长融合时，0.25%的胰酶消化传代培养，实验用第3～8代细胞。VSMCs鉴定：应用α-actin免疫组化染色，细胞95%以上呈阳性；倒置显微镜下，平滑肌细胞为梭形，呈贴壁极性生长，高低起伏呈“峰”、“谷”状。 1.2.3 分组实验 将处于对数生长期的VSMCs移入6孔板中，用含10mmol·L－1 β-GP的培养液于37℃、5%CO2的培养箱中培养，至细胞80％融合（细胞计数2×104 L－1），换用不含血清的DMEM维持液培养24h，使细胞同步于G0期，弃上清，然后分别用0、50、100、200及400mg·L－1的AGE-BSA干预48h（其中0mg·L－1AGE-BSA为未干预组），选取敏感浓度200mg·L－1的AGE-BSA分别干预0、12、24、36、48、72h（其中0 h也为未干预组）。同时设BSA组及普通培养液培养10 d的DMEM组。每组设3个复孔。 1.2.4 细胞总RNA的提取 各组至培养终点后，每孔弃培养液以Trizol法提取细胞总RNA,经紫外分光光度计测定RNA的A260