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胃癌组织中KAI1 mRNA表达意义 　 作者：刘茗露 刘斌 邢传平 陈一伟 郭峰 【摘要】 　　目的： 探讨KAI1基因和蛋白在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及癌组织中的表达及其与之发生、发展的关系. 方法： 应用原位杂交技术和免疫组织化学技术检测不典型增生胃黏膜65例及胃癌组织74例中KAI1mRNA和 KAI1蛋白的表达. 结果： KAI1 mRNA和KAI1蛋白在胃癌组织中表达显著降低，与正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜组织中表达的差异有显著性意义（χ2=36.328，Plt;0.05）. 在胃癌组中不同的浸润深度、有无淋巴结转移和脉管侵犯组中阳性表达率的差异性有统计学意义（Plt;0.05）；而在年龄、性别组间的差异性无统计学意义（Pgt;0.05）. 结论： KAI1mRNA和蛋白低表达在胃癌组织中的发生、发展中可能起着重要作用，有望成为早期诊断、评估肿瘤细胞侵袭转移潜能的指标之一. 【关键词】 胃肿瘤 KAI1 原位杂交 免疫组织化学 0引言 胃癌是消化道最常见的肿瘤， KAI1基因产物与CD82结构相同，参与细胞黏附、运动和信号转导，与多种肿瘤的转移和预后有密切关系［1］，作为一个肿瘤转移抑制基因，表达降低可使细胞细胞基质的黏附力改变及细胞间相互作用降低. 故KAI1基因在胃癌组织中的表达水平值得关注，但国内及国外目前对于KAI与消化道肿瘤的报道意见不甚一致. 我们用原位杂交法和SP 免疫组化方法检测正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及癌组织中KAI1mRNA和KAI1蛋白的表达，以探讨在胃癌发生发展、转移浸润过程中相关基因间的作用、关系及其意义，为该肿瘤的诊断治疗提供依据. 1材料和方法 1.1材料200408/200507病理科存档石蜡标本. 不典型增生胃黏膜65例，轻、中、重度不典型增生分别为20，21和24例. 胃癌组74(男49，女25)例，年龄30～84（中位62）岁，术前均未行放疗和化疗，高、中、低分化腺癌分别为21，24，21例,黏液细胞癌8例；淋巴结转移阳性组36例，淋巴结转移阴性组38例；有脉管侵犯者25例，无脉管侵犯者49例；标本均经40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚切片，分别进行HE、免疫组化及原位杂交染色. 同时取距离肿瘤组织gt;5 cm的胃黏膜22例作为非肿瘤组织对照. 胃癌组织20例采用了组织芯片的方法；其余组织则采用了常规切片的制作方法. 兔抗人KAI1，过氧化酶标记的链霉卵白素染色试剂盒、DAB显色试剂盒及原位杂交检测试剂盒（PanPath产品）购自北京中杉金桥生物技术有限公司. 鼠抗人KAI1单抗为美国Pharmingen公司产品. KAI1寡核苷酸探针序列为：① 5′AGGA TCCAC ACCCC GAAGC CCAGG ATCACT 3′；② 5′CAGCG CTTCA CCTGA GCCTG CACGT AGTCC 3′探针片段长度21 bp，3′端标记地高辛，由上海生工有限公司合成. 组织芯片制作：用特殊基质制作25 mm×25 mm×5 mm的空白载体；用直径0.5 cm的骨髓穿刺针在每块空白基质载体打孔，相邻孔间为1 mm；对常规固定的的大体胃癌标本进行穿刺，获取直径为0.4 cm柱形组织，放入基质载体已打好的孔里，癌组织部分朝向包埋面，进行脱水、浸蜡、包埋. 制作组织芯片蜡块，将组织芯片蜡块以4～6 μm厚连续切片，敷贴于10 g/L多聚赖氨酸处理的载玻片上，分别进行HE染色、免疫组化及原位杂交染色. 1.2方法 1.2.1原位杂交所有器皿、玻片、缓冲液、双蒸水均予灭活RNA酶处理，玻片及盖玻片均予硅化处理. 石蜡切片常规脱蜡至水，30 mL/L H2O2室温处理10 min以灭活内源性过氧化物酶，双蒸水洗涤3 min×2次. 切片上滴加30 mL/L盐酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃消化30 min，级别乙醇中脱水. 变性及杂交：每张切片加地高辛标记KAI1探针20 μL，加专用盖玻片，置95℃烤箱变性5 min；37℃杂交过夜，TBS液洗涤去掉盖玻片，加生物素化鼠抗地高辛，37℃孵育30 min，TBS液洗涤3 min，双蒸水洗涤1 min，DAB显色，苏木素复染，封片. 实验设空白对照和阳性对照（采用在所有人体组织中均表达的人Alu片断寡核苷酸探针）. 原位杂交胞膜上及胞质中出现棕褐色颗粒为阳性染色，（-）为无杂交信号；（+）杂交信号为弱阳性；（）杂交信号为阳性；（）杂交信号为强阳性. 1．2．2免疫组化组织切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水后行免疫组化染色. 采用高压锅高温抗原修复后，余步骤按SP法试剂盒说明书进行操作. DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固. PBS代替一抗作为阴性对照. 免疫组化KAI1蛋白阳性为胞膜上及