血清胆固醇的定量测定.ppt

7.吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层“液膜”，第二次吸取时的体积会大于第一次的体积。 8.卸掉的吸头一定不能和新吸头混放，以免产生交叉污染。 实验二 血清胆固醇的定量测定（磷硫铁法） 一、实验目的 1、学习并掌握磷硫铁法测定血清中总胆固醇含量的原理及操作； 2、学会制备无蛋白血清 ； 3、了解血清总胆固醇的正常值范围及临床意义 。 二、实验原理 胆固醇的分子结构 3 17 1 胆固醇主要存在于动物细胞，参与膜的组成，质膜中的含量比细胞器膜中的多。胆固醇也是血中脂蛋白复合体的成分；并与粥样硬化有关，它是动脉壁上形成的粥样硬化斑块成分之一。胆固醇也是类固醇激素和胆汁酸的前提。 1784年，从胆石中提取出胆固醇。 总胆固醇的测定方法： 磷硫铁法 化学比色法 醋酸酐法 邻苯二甲醛法 酶学方法（试剂盒） 用无水乙醇提取血清中的胆固醇，再与磷硫铁试剂作用，产生颜色反应，呈色度与胆固醇含量成正比，可用比色法测定血清中胆固醇含量。 血清经无水乙醇处理后蛋白质被沉淀，胆固醇及其脂则溶解在无水乙醇中。在乙醇提取液中加入硫磷铁试剂（即浓硫酸和三价铁溶液），胆固醇及其脂与试剂反应形成比较稳定的紫红色化合物，呈色程度与胆固醇含量成正比，可于560nm 波长下进行比色测定。 正常血清中胆固醇的含量有随年龄增大而增加的趋势，其平均正常值在110～220mg/100mL。 胆固醇含量在400mg/100ml内，与A值成良好线性关系。 三、实验器材 1、人血清 2、可见分光光度计 3、台式离心机（4000r/min） 4、离心管 5、试管 6、移液管。 四、实验试剂 1、10%三氯化铁溶液：10.0g FeCl3·6H2O 溶于浓磷酸中，定容至100ml； 2、磷硫铁试剂(P-S-Fe 试剂)：取10%三氯化铁溶液1.5ml于100ml棕色容量瓶内，加浓硫酸至刻度； 3、胆固醇标准贮液：准确称量胆固醇80mg，溶于无水乙醇，定容至100ml； 4、胆固醇标准溶液：将贮液用无水乙醇准确稀释10倍即得，此标准液含0.08mg/mL胆固醇。 5、无水乙醇 五、操作 1、胆固醇的提取 吸取血清0.1ml置干燥离心管内，先加无水乙醇0.4ml，摇匀后再加无水乙醇2.0ml，摇匀，10min后离心（3000r/min-6000r/min）5min，取上清夜备用。 2、比色测定 取干燥试管3支，编号，分别加入无水乙醇1.0ml（空白管），胆固醇标准溶液1.0ml（标准管），上述乙醇提取液1.0ml（样品管），各管皆加入磷硫铁试剂1.0ml，摇匀，10min后，分别转移至比色杯内，用可见分光光度计在560nm处比色。 管号/试剂 空白管 标准管 测定管 无水乙醇 1.0ml 胆固醇标准液 1.0ml 乙醇抽提液 1.0ml 磷硫铁试剂 1.0ml 1.0ml 1.0ml A560 注：磷硫铁试剂须沿管壁缓缓加入，与乙醇液分成两层，立即迅速振摇20次，放置10分钟（冷却至室温）后，于560nm进行比色，以空白管调零读取各管吸光度。 六、计算 100ml血清中胆固醇的质量（mg） A1C0 m= ÷0.04×100 A0 注意事项： 1、颜色反应与加磷硫铁试剂混合时的产热程度有关，因此，所用试管口径和厚度要一致；加磷硫铁试剂必须与乙醇分成两层，然后混合，不能边加边摇，否则显色不完全；磷硫铁试剂要加一管混合一管，混合的手法、程度也要一致；混合时试管发热，注意勿使试管内液体溅出，以免损伤衣服、皮肤和眼睛。 2、所用试管和比色杯均须干燥，浓硫酸的质量很重要，放置日久，往往因为吸收水分，而使颜色反应降低。 3、空白管应接近无色，如带橙黄色，表示乙醇不纯，应用去醛处理。 移液枪的使用 吸嘴的安装 散装吸嘴安装 盒装吸嘴安装 注意事项 错误操作：在将枪头套上移液枪时，很多人会使劲地在枪头盒子上敲几下。这样会导致移液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住，严重的情况会将白套筒折断。 正确操作：将移液器垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。 设定容量 注意事项 1、移液器要在规定的容量内使用，切勿超量程使用，否则会卡住内部机械装置而损坏了移液器