含组氨酸标签的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶性质的分析研究.pdfVIP

摘要 所有四吡咯化合物如血红索、叶绿素和维生素B12等对大部分生物体有非常 重要的作用，它们合成的第一个共有底物是5．氨基酮戊酸。共有反应的第一步是 两分子的5一氨基酮戊酸缩合成一分子的胆色素原，由5．氨基酮戊酸脱水酶 (5一aminolevulinate dehydratase，ALAD)，又名胆色素原合酶的酶所催化。 已从数个物种中纯化了ALAD，它是一个金属蛋白，不同生物中的ALAD 依赖不同的金属离子。在微生物和哺乳动物中，ALAD是同源八聚体，在植物中 是六聚体。已从近百个物种中克隆了ALAD的基因，所有物种的ALAD的氨基 酸序列比对显示有约35％的同源性。利用重组技术定点突变确定了数个物种 ALAD起催化作用的必需氨基酸残基。数个物种的ALAD的晶体结构显示酶活 中心高度保守。枯草杆菌的ALAD基因和大肠杆菌的基因高度保守，但枯草杆 菌的ALAD酶活中心的保守氨基酸序列和大肠杆菌略有不同。迄今未有枯草杆 菌ALAD性质的报道。ALAD催化合成的产物PBG，不仅可以用于后续的酶活 分析，而且也是癌症药物的前体。 本实验从枯草杆菌克隆ALAD基因，在大肠杆菌中表达并测定其酶学性质， 研究内容及结果如下： 1．重组枯草杆菌ALAD表达载体的构建 以枯草杆菌基因组为模板，通过PCR方法扩增枯草杆菌编码5．氨基酮戊酸 脱水酶基因(hemB)。测序结果和报道的枯草杆菌hemB序列一致。将NdeI和 EcoR I双酶切的纯化产物插入同样处理的pET-28a中构建成表达载体。 2．5-氨基酮戊酸脱水酶的高效表达与一步纯化 构建的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)，在37℃，0．5mmol／L的IPTG 下诱导5h，重组蛋白获得高效表达。SDS．PAGE检测到41kD的特异带，表达 菌株的上清检测到ALAD的比活为164 U·m百1，表明酶以活性形式表达，组氨酸 标签不显著影响酶活。利用ALAD加在N端的组氨酸标签，通过Ni_NTA进行 纯化，SDS．PAGE表明可纯化至均一。 3．5．氨基酮戊酸脱水酶的酶学性质 kDa， 枯草杆菌ALAD的酶的亚基分子质量约为41kDa，全酶分子量为330 Iranol， 表明酶由8个同亚基寡蛋白组成；最适pH为8．O；动力学参数K．m为7．4 mmol·h～；在55℃温浴10 V。。为0．54 rain，保留85％的酶活，表明热稳定性 力，最高达将近200％，Cu“和Hg计却显著地抑制了酶活。随B。巯基乙醇浓度的 增加至10 mmol／L，酶活随之增加，p一巯基乙醇保护催化产物免于氧化。高浓度 的还原剂二硫苏糖醇抑制酶活，推测它影响酶活中心半胱氨酸和金属离子的结 合。数个氨基酸修饰剂的修饰结果表明，赖氨酸和半胱氨酸残基是酶催化必需的， 而组氨酸和丝氨酸残基修饰仍然有一定酶活，主要是修饰剂改变了酶的空间结 构。 关键词：枯草杆菌，5一氨基酮戊酸脱水酶，组氨酸标签，酶学性质 II Abstract All andvitamin the tetrapyrroles B12 roleinthe such∞hemes，chlorophyllsplay important life．Thefirstcommon intermediateforall is5-aminolevulinate tetrapyrroles fALA)．Two moleculesofALAis condensedtoon