抗细胞粘附肽LDV及其衍生物的合成、修饰和抗炎免疫药理活性实验的分析研究.pdf

中文摘要 抗细胞粘附肽LDV及其衍生物的合成、修饰 和抗炎免疫药理活性实验研究 摘 要 目的：’细胞粘附分子极迟抗原．4(Ⅵ丛．4)在炎症中介 导白细胞的粘附和渗出、是目前国际公认的抗炎药物的新靶 之结合的关键序列。近年来，以LDV序列为基础的小分子 肽类拮抗剂的开发，已经成为国际上抗炎药物研究的热点之 一。但是，与其它小分子肽类药物的性质相似，V】A．4的 U)V类小分子拮抗肽由于分子量小，易被酶解破坏和清除， 体内半衰期极短。 聚乙二醇(PEG)是一类具有良好生物相容性的无毒无 活性的聚醚高分子化合物，经PEG修饰可以增加蛋白质及肽 的酶解稳定性、延长血浆衰期、增强生物利用度、提高药物 疗效和安全性。自20世纪90年代以来，已经有多个聚乙二 醇修饰的蛋白类药物在美国经FDA批准上市，但聚乙二醇 修饰肽类药物的研究国外和国内均刚刚起步，资料很少。 本项研究采用分子量为2000的单甲氧基聚乙二醇 免疫药理活性分析，以初步探讨聚乙二醇修饰ⅥA一4的LDV 类小分子拮抗肽类药物的可行性，为进一步的具有较长血浆 半衰期和生物学活性等良好药效和药代动力学特征的、具有 自主知识产权的、PEG修饰的Ⅵ认．4拮抗肽类新型抗炎药 中文摘要 物的开发研究提供基本的实验方法和实验数据支持，并为肽 类药物的聚乙二醇修饰研究提供基本的技术方法、构建技术 平台。 方法： ·．j 1合成设计 ．’ 合成产物1结构：ku．Asp．Val，为被修饰短肽。’： 肽，设计参考Ta眦az所合成的环肽。环肽的基本结构为两 段ⅪU)VA首尾相连，已证实具有良好的生物活性。 合成产物3 CH2CH2COOH 结构：n巾EG2000．NHCO ．Leu．Asp．Val，为Leu．Asp．Val的PEG修饰物。 修饰物。 其中合成产物3、4的PEG修饰位点设计于被修饰肽的 N．末端，基本意图是保证LDV肽配体结合活性的关键氨基 酸残基舡p不被修饰物屏蔽。 2肽合成及其PEG修饰 采用Fmoc固相法，以．wang树脂为载体，依次进行保 护氨基酸的缩合反应，经肽树脂裂解，Sephadex凝胶脱盐和 Lys—11e-Leu一心p—Val枷a。 上方法经肽树脂裂解，Sephadex凝胶脱盐和HPLC纯化后， 中文摘要 和 mPEG2000 -舢p—Val -舢p—Val一～a。 对以上合成和修饰产物进行HPLC和MS分析鉴定。 3合成产物的的抗炎免疫药理活性分析 采用卵白蛋白(OVA)雾化吸入诱发制备豚鼠过敏性哮 喘模型。制模豚鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半。 治疗组豚鼠分别于制模第15天开始，腹腔注射受试合成或 修饰产物5m眺g，空白和阳性药物对照组豚鼠分别腹腔注射 生理盐水2m1或地塞米松10m酣睡，每日1次，连续7天。 末次给药后一小时，各组豚鼠OVA雾化吸入引喘，测定引 喘潜伏期和引喘后跌倒率；戊巴比妥钠腹腔注射麻醉豚鼠， 嗜酸性粒细胞，计数；使用48孔细胞趋化反应盒观察合成 产物对嗜酸性粒细胞的趋化抑制作用；进行嗜酸性粒细胞过 氧化物酶(EPO)活性测定；肺组织以10％甲醛固定，进行 病理学组织学检查。 采用Wistar大鼠人工造囊，观察适宜浓度合成及修饰产 物作用7．5小时，对大鼠经CMC．刺激白细胞游出的影响。 结果： 1HPLC检测分析结果：纯化后的合成及修饰产物LDV、 中文摘要 与预期相符。 2动物整体症状和体征观察、细胞分析和病理组织学检 查结果：本实验设计合成的LDV及其衍生物ⅪLDVA肽、 蛋白(OVA)诱发的豚鼠的过敏性哮喘及其肺泡和支气管局 部组织嗜酸性粒细胞的浸润和渗出表现了较强的拮抗活性，． 在等剂