作物dna分子标记辅助育种.docVIP

第二章 DNA标记技术 生命的遗传信息存储于DNA序列之中，高等生物每一个细胞的全部DNA构成了该生物体的基因组。基因组DNA序列的变异是物种遗传多样性的基础。尽管在生命信息的传递过程中DNA能够精确地自我复制，但是许多因素也能引起DNA序列的变化，造成个体之间的遗传差异。单个碱基的替换、DNA片段的插入、缺失、易位和倒位等都能引起DNA序列的变异。 利用现代分子生物学技术揭示DNA序列的变异（遗传多态性），就可以建立DNA水平上的遗传标记。从1980年人类遗传学家J. G. K. Botstein等首次提出DNA限制性片段长度多态性作为遗传标记的思想及1985年PCR技术的诞生至今，已经发展了十多种基于DNA多态性的分子标记技术，这些DNA标记技术综合起来可分为以DNA杂交为基础的和以PCR为基础的以及PCR技术和限制性酶切技术相结合的几种类型。显然，检测DNA水平上的遗传变异最精确的方法是直接测定DNA序列，通过对测定的DNA序列进行分析比较，即可揭示生物体间在单个核苷酸水平上的遗传多态性。基于这一原理，最近发展了SNP标记，即单核苷酸多态性标记。尽管在植物分子标记研究中还未见这一技术的应用报道，但其应用前景是十分美好的。因此，本章在最后一节对这一新技术作了简要阐述。 第一节 基于DNA-DNA杂交的DNA标记 基于DNA-DNA杂交的DNA标记主要包括RFLP标记和VNTR标记。这类标记是利用限制性内切酶酶解不同生物体的DNA分子后，用同位素或非同位素标记的随机基因组克隆、cDNA克隆、微卫星或小卫星序列等作为探针进行DNA间杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。VNTR多态性是由重复序列数目的差异性产生的，而RFLP多态性主要是由于DNA序列中单碱基的替换、DNA片段的插入、缺失、易位和倒位等引起的。RFLP标记是发现最早、应用广泛、具有代表性的DNA标记技术。 一、RFLP标记技术 RFLP即限制性片段长度多态性。这种多态性是由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变引起的。 限制性内切酶是一种能识别DNA上特定碱基组成的序列并在这些序列位点上切断DNA分子的酶。这些特定碱基组成的DNA序列叫做相应内切酶的识别位点或限制性位点，长度一般在4至8个碱基对之间。如PstⅠ的限制性位点是（其中箭头表示被切开的位置）： 5’ C TGCA↓G 3’ 3’ G↑ACGT C 5’ 通常DNA上存在大量的限制性内切酶酶切位点。因此，限制性内切酶能将很长的DNA分子酶解成许多长短不一的小片段，片段的数目和长度反映了DNA分子上限制性酶切位点的分布。特定的DNA／限制性内切酶组合所产生的片段是特异的，它能作为某一DNA（或含有该DNA的生物）DNA分子水平上直接反映了生物的遗传多态性。 图2.1给出了产生RFLP的原理示意图。如果某一个限制性位点发生了突变，这个限制性内切酶将不再识别这个位点，不再进行酶切反应，产生片段的大小将由最邻近的限制性酶切位点决定。由于植物基因组很大，某种限制性内切酶的酶切位点很多，经酶解后会产生大量大小不一的限制性片段，这些片段经电泳分离形成的电泳谱带是连续分布的，很难辨别出某一限制性片段大小的变化，必须利用单拷贝的基因组DNA克隆或cDNA克隆作为探针，通过Southern杂交技术才能够检测到。可见，要进行RFLP分析首先要分离单拷贝的基因组DNA克隆或cDNA克隆，才能进行多态性分析。一些作物如玉米、水稻、番茄等已有覆盖整个基因组的克隆，很容易从有关单位或商家索取或购买到。但大多数作物还没有覆盖整个基因组的克隆，仍需要研制特异探针。由于具有大量的酶和探针组合可供选配，因此任何一种作物都具有大量的RFLP标记数量。RFLP标记具有共显性、信息完整、重复性和稳定性好等优点。但RFLP技术的实验操作过程较复杂，需要对探针进行同位素标记，即使应用非放射性的Southern杂交技术，仍然是个耗时费力的过程。 图2.1 RFLP标记多态性的分子基础 二、VNTR标记技术 许多生物体的DNA存在含有大量的串联重复序列的高变异区。通常将以15～75个核苷酸为基本单元的串联重复序列称为小卫星（Minisatellites），以2～6个核苷酸为基本单元的简单串联重复序列称为微卫星（Microsatellites）或简单序列重复（SSR）。小卫星和微卫星也常常称作重复数可变串联重复（VNTR）标记。VNTR标记产生的多态性是由同一座位上的串联单元数量的不同而产生的。图2.2为VNTR变异的原理示意图。利用VNTR标记可进行分子定位和作图的研究工作。 为了使VNTR成为有用的DNA标记，需发展一种能够快速鉴定VNTR座位的技术。理想的途径之一是利用PCR进行扩增，所得PCR产物通过电泳即可比较