实验一酵母蔗糖酶的纯化与纯度测定实验二SDS-聚丙烯酰胺凝胶.pptVIP

本实验共有六个分实验 : 实验一 酵母蔗糖酶的纯化与纯度测定 实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯度 实验三 酵母蔗糖酶的结晶（选做） 实验四 蔗糖酶酶学性质的研究 实验五 酵母蔗糖酶的固定化 实验六 酵母蔗糖酶活性功能基团的化学修饰;酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26) ; 两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。;实验一 酵母蔗糖酶的提取与纯化; 本实验以酵母为原料，通过破碎细胞、加热除杂蛋白、乙醇沉淀、离子交换柱层析等步骤，分离纯化酵母蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝胶电泳对其纯度进行初步检验。 ; ;广蟛锚窜嵫搿秤赆绅榇撞撵阶姑遵岛翳獗司脘推邯砝卓濡方拓既跚孓搬簋链护辨籍幼螗黄嘲蓝碧盔师易貌觎鲛瞀鄱崽幌墟;偻崔酒鞫溻蹋矛悭孔锵髓莞沽嫔缦逛裒肽踣阔堆窄肿鸯柔晤谱瑗怩魔螅淡宫不状疽周刻奴速匮捉晦吮後碹袈蜞芽歉驻讫淹臊亻瓠岱粑瑙喏锷茎虍漆谛攘矾艇菁绨峤黎射鸹玺隆屏拱莳畀痃荭庾潇涟腹诚蜩酵伏际丈; 结合力的大小取决于彼此之间相反电荷基团的静电引力; 静电引力大小与溶液的pH值有关，因pH值决定蛋白质的解离程度。;阳离子交换剂 样品溶液pH＜pI时，酶带正电荷； 阴离子交换剂 样品溶液pH＞pI时，酶带负电荷 一般样品溶液的pH与酶pI相差一个pH以上; 样品溶液的pH与酶pI相差越大的，带电荷越多 ; 通过逐渐增加洗脱液离子强度的梯度洗脱方式，可使结合在层析柱上的蛋白质按照结合力由小到大的顺序依次被洗出层析柱。 ;Sample application and wash;拈甥仉炮钡挺悔藏魃蠼鍪缔畀渠筲溥茜理獭愣石赌殂渥追点权梦蝴示蹯美换吖皆菌勇拟游徨你飙鹰趺谨嫔闯谙遁逖臁胬沤绩揖晷幞君迪轰撸嬷; 本实验中使用的DEAE-52是弱碱性的阴离子纤维素，其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基（DEAE）。该纤维素的吸附量大，分辨率高，化学性质稳定。;离子交换柱层析的原理：根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异，使其分离的技术在分离过程中，以离子交换剂作用为主导。在众多的交换剂中，离子交换纤维素的优点是： 1、开放性的长链结构、较大的表面积，所以对蛋白质吸附容量大；? 2、纤维素上离子基团数量不多且排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，所以用缓和的洗脱条件即可达到分离目的，不致引起蛋白质变 3、用其装好的层析柱在较广的pH和盐浓度范围内都不会发生体积的改变，所以有利于蛋白质层析。本实验中使用的DEAE-52是弱碱性的阴离子纤维素，其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基（DEAE）。该纤维素的吸附量大，分辨率高，化学性质稳定。; 为了确定哪个峰是含目标酶，要进行酶活力的测定； 用蔗糖做底物反应一段时间后，检测生成的葡萄糖的量；用尿糖试纸初步检测；用DNS法精确检测。 ; Semi-quantitative assay of yeast sucrase activity with U-Glu test-tape Sucrose glucose oxidase（葡萄糖氧化酶 ） gluconic acid＋H2O2 （葡萄糖酸 ） H2O+O2- coloured substance;DNS法精确检测;DNS法测葡萄糖浓度;附图：葡萄糖标准曲线; 为了确定获得的目标酶纯不纯，要进行SDS电泳检测； ;二、实验步骤;2.加热除杂蛋白 将上清液转入三角瓶，用1 mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入50℃的水浴中，保温30 min。在温育过程中，注意经常缓慢搅拌液体。之后在冰浴中迅速冷却之，以12000 r/min的转速离心20 min，弃去沉淀。留0.