葡聚糖凝胶Sephadex G–25柱层析法脱盐分离蛋白质实验技术总结.pptVIP

引 言 层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家Michael等发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。1944年出现纸层析， 以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。 凡盐析所获得的粗制蛋白质（如盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法。  一、实验目的 （1）掌握葡聚糖凝胶柱层析法脱盐分离蛋白质的原理 （2）学会葡聚糖凝胶柱层析法脱盐和分离蛋白质实验操作技术 二、基本原理 当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。  凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶过滤（gel filtration）、分子筛过滤（molecular sieve filtration） 等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。 凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。 小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶 柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。 这是由葡萄糖的多聚物与1–氯– 2、3–环氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例（交联度）来控制。  常以G–10至G–200号码标记  G： 反应凝胶的交联程度、膨胀程度等 G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。 如G–25即表示吸水量为2.5ml/1g干胶。 市售有G–10、G–25、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型号。 G–75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G–75以下的称为硬胶。 葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。 一般说Sephadex G - l0～15通常用于分离肽及“脱盐”。 Sephadex G–75～200用以分离各类蛋白质。  凝胶层析是一种物理分离法。葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈多惰性，不与被分离物质发生反应，所以分离的效果较好。 三、操作  1. 凝胶溶胀（凝胶的用前处理 ）  商品葡聚糖凝胶为干燥颗粒。使用前必须水化溶胀，凝胶溶胀有两种方法： 一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中于室温下溶胀；另一种是置于沸水浴中溶胀。各种葡聚糖凝胶在上述溶胀方法中所需的时间见下表： 目前多用“热法”溶涨，这样可大大加速溶涨平衡，通常1—2h即可完成。“热法”溶涨还可以消毒，杀灭凝胶中污染的细菌，同时也排除了凝胶内的汽泡。 可见，不同类型的各种凝胶溶涨所需的最少时间是不相同的，请参考有关的技术数据。 在凝胶溶涨的处理过程中，不能进行剧烈搅拌，禁止使用电磁搅拌器，以为这样会使凝胶颗粒破裂而产生碎片。 2. 装柱  将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法。 作层析用的柱子称层析柱。 柱子的一端为进口，另一端为出口，出口端底部有烧结玻璃砂板 ，能阻止层析剂流出，溶剂则可流过。 层析柱的长短粗细根据实验的目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长，分离效果越好。但柱过长，层