昆虫离体培养细胞抗菌肽的诱导、纯化及鉴定.pdfVIP

摘 要 昆虫是自然界中最大的生物种群之一，它们高度的适应性和防御机能来自 其体内高效的免疫系统。研究昆虫的免疫，除其本身的意义外，也将促进人类 对免疫问题的总体认识，昆虫免疫的研究是当前一个迅速发展的领域。抗菌肽 是昆虫免疫系统的重要组成部分，抗菌肽的诱导、表达及其协同作用于外源微 生物，构成昆虫先天性防御系统中极为重要的环节。它具有分子量小，热稳定 性强，水溶性好，无免疫原性，生物活性广泛等特点，在医药卫生、农业、食 品工业以及动、植物抗病转基因工程等领域显示出巨大的发展潜力，抗菌肽的 研究已成为昆虫免疫学及分子生物学的研究热点之一。 体外培养的免疫应答细胞的增殖为我们深入了解高等哺乳动物的免疫反应 打下一定的基础，相比之下，利用体外培养的细胞来研究昆虫的免疫才刚刚开 始。近年来，国外科学家成功地从十几种昆虫细胞系中诱导、分离和鉴定了多 种抗菌活性物质，从而证明了利用离体细胞系来研究昆虫免疫的可能性及适应 性。而国内尚未见这方面的报导，这方面的研究还是一个全新的领域，本论文 正是从这一崭新的角度来研究昆虫的免疫，探讨建立一个通用的体外快速诱导 筛选、快速分离纯化及鉴定的技术体系，并将其延伸到其它动物细胞系。通过 研究，本实验筛选到一株诱导抗菌活性较高的昆虫细胞系，并从中分离纯化出 一种新的抗菌活性较广的抗菌肽。 实验选取三种离体培养的鳞翅目昆虫细胞系：甜菜夜蛾(Spodopteraexigua) litura)卵细胞系sL(简称sL)， 血细胞系SE(简称SE)，斜纹夜蛾(Spodoptera 粉纹夜蛾(Trichoplusia 的大肠杆菌对其进行诱导，并做活性检测、诱导动力学研究及电泳分析。结果 发现其中粉纹夜蛾5131细胞的诱导抗菌活性最高，甜菜夜蛾SE细胞的活性其 次，斜纹夜蛾SL细胞的活性最低。而且诱导动力学分析发现粉纹夜蛾581细 胞的诱导抗菌活性随着诱导时间的增加而逐渐上升，在诱导16小时达到最高， 随后逐渐下降。采用TrieineSDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，发现581细胞诱导 前后有明显的差异，主要表现为诱导后产生了—条分子量大约为8000Da的新条 带，从而581细胞的诱导抗菌活性是由这条新带代表的多肽一抗菌肽所产生。 采用10种动物病源细菌、1种百挚母菌和8种植物病源真菌作为检测指示菌，测 定581细胞诱导抗菌肽的抗菌谱，结果发现该抗菌肽的抗菌谱较广，对大部分 检测菌有不同程度的抑制作用，从而说明这是一种既抗细菌又抗真菌的抗微生 物肽。 然后对粉纹夜蛾581细胞诱导产生的抗菌肽进行分离、纯化和鉴定。首先 利用AKTA exploreI快速工艺开拓系统进行抗菌肽的初步分离，这个过程分两 Fast Flow离子交 G．25凝胶过滤层析(2)CM．Sepharose 步完成：(1)Scphadex 换层析。然后利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行抗菌肽的进一步纯化， 4．6／250ⅡHn)色谱柱。最后利用Applied 选用Sephasil刑C18 Pcptide(ST Laser Of Time Mass MS)进行 Flight Spectrometer,MALDI—TOF Desorption／Ionization Mass 抗菌肽的精确分子量测定和肽指纹图谱(Peptidc Mass 鉴定，结果测得该抗菌肽的精确分子量为7691Da,将肽指纹图谱(Peptide 进行