PI3K-Akt抑制剂联合顺铂治疗肺癌实验探究.docVIP

PI3K/Akt抑制剂联合顺铂治疗肺癌实验探究 　 作者：吴秋歌 王静 蒋军广 苗丽君 【摘要】 目的 探讨PI3K/Akt抑制剂LY294002〔2（4吗啉基）8苯基4氢1苯并吡喃4酮〕联合化疗药物顺铂（DDP）治疗肺癌的效应及可能机制，以期为肺癌的临床治疗提供新的理论依据。方法 培养肺腺癌A549细胞，采用MTT方法及流式细胞仪检测LY294002联合DDP对A549细胞增殖及凋亡的影响；通过裸鼠移植瘤实验检测LY294002联合DDP对A549细胞成瘤性的影响。结果 在一定剂量范围内，LY294002与DDP均可抑制A549细胞的生长，其抑制作用呈量效关系。LY294002与DDP联合作用可增强对A549细胞的抑制作用。LY294002与DDP均可有效的诱导A549细胞凋亡，联用后凋亡率显著增加。裸鼠移植瘤实验显示，LY294002与DDP均可抑制移植瘤的生长，联用后抑瘤率增加。结论 LY294002可增强DDP对A549细胞、裸鼠移植瘤的抗肿瘤作用，该作用可能是通过增强对Ａ549细胞增殖的抑制以及诱导其凋亡来实现的。 【关键词】 肺肿瘤；凋亡；PI3K；LY294002；顺铂 细胞生存信号的转导对肺癌的发生发展起着至关重要的作用。PI3K/Akt信号转导通路在国外被视为癌细胞存活的首要通路。近年来对Akt的研究发现，Akt能够通过磷酸化其下游的多种作用底物促进对化疗和放疗的抵抗。PI3K/Akt抑制剂LY294002〔2 (4吗琳基)8苯基4氢1苯并毗喃4酮〕可增强某些抗肿瘤药物的疗效，减少化疗抵抗〔1，2〕。而LY294002对肺癌的研究还处于初始阶段，本研究旨在对PI3K/Akt的抑制剂LY294002与化疗药物顺铂（cisplatin，DDP）联用对肺癌细胞株A549及裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其机制进行探讨，为肺癌治疗提供实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞株与试剂 人肺腺癌细胞株Ａ549购自中科院上海细胞生物研究院；F12K培养基、LY294002及噻唑蓝(MTT)购自sigma公司；胎牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所；DDP（云南个旧生物药业有限公司，国药准字；裸鼠由北京大学医学院实验动物中心提供。 　　1.2 细胞培养 A549细胞用F12K培养基，于37℃、5%CO2培养箱内培养。细胞为贴壁生长，0.25%胰蛋白酶消化传代。 　　1.3 MTT比色分析法 检测LY294002对A549细胞生长抑制作用。取对数生长期Ａ549细胞按1×104/孔接种于96孔培养板，每孔加液量200 μl。于培养24 h后换液，设空白调零组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶剂)及实验组(加不同浓度的DDP，DDP浓度依次为0.5、1、2、4、8、16 μg/ml，每组LY294002终浓度分别为20 μmol/L)，每组设6个复孔。于培养48 h后加入MTT(5 g/Ｌ)20 μl，继续培养4 h后吸出上清，每孔加二甲基亚砜（DMSO）150 μl，振荡溶解10 min，待结晶完全溶解后，在酶联免疫测定仪上选择波长490 nm，空白孔调零，测定各孔吸光度Ａ。计算细胞生长的抑制率，抑制率=(1-实验组Ａ平均值/对照组Ａ平均值)×100%。 　　1.4 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率的变化 取对数生长期的A549细胞，调整细胞浓度为2×105/ml接种于培养瓶，加入上述不同浓度的药物（LY294002终浓度为20 μmol/L， DDP终浓度别为3 μg/ml），培养48 h后获取细胞，制成单细胞悬液， 4℃ 70%冷乙醇固定，放置4℃冰箱固定12 h以上。检测时，弃去乙醇，加入0.5%胃蛋白酶1 ml（pH值 1.5～2.0）消化，采用碘化丙锭（PI）一步插入性DNA定量荧光染色法，上机检测细胞周期和细胞凋亡率。 　　1.5 裸鼠移植瘤模型的建立与干预 24只裸鼠，均为雌性，鼠龄为3～4 w，体重约18～20 g，实验和饲养均在无特定病原（SPF）条件下进行。随机将裸鼠分为4组：对照组、LY294002组、DDP组和LY294002+DDP组，每组6只，于裸鼠右上背部皮下接种对数生长期的A549细胞1×107/0.2 ml。待1 w后肿瘤长出。①LY294002组：给予LY294002 25 mg/kg，腹腔注射，每周2次；②对照组：等量生理盐水，腹腔注射；③DDP组：给予DDP 4 mg/kg，腹腔注射；④LY294002＋DDP组： LY294002 25 mg/kg＋DDP 4 mg/kg，腹腔注射；共3 w。裸鼠于最后注射药物2 d后处死，用药3 w。实验中注意观察裸鼠精神、进食、排便及体重情况，隔日测裸鼠体重及移植瘤直径。实验结束取出移植瘤