FicolinA克隆、 蛋白表达及抗体制备及鉴定.docVIP

FicolinA克隆、 蛋白表达及抗体制备及鉴定 　【摘要】 目的: 克隆小鼠ficolinA（mouse ficolinA）基因, 构建在真核及原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达和鉴定其蛋白, 并制备其抗体, 以进一步用于研究小鼠ficolinA的功能。方法: 用RTPCR的方法从新生7 d的C57BL/6小鼠肝脏中运用GeneRacer kit扩增ficolinA cDNA片段, 并将该片段分别插入pVAX1真核表达载体及pGEXKG 原核表达载体中, 实现插入基因的融合, 在IPTG的诱导下在大肠杆菌中表达。用GSTSepharose 4B的柱子对表达的融合蛋白进行纯化, 用SDSPAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。制备ficolinA的多克隆抗体并对其效价进行测定。结果: 成功地构建了pVAX1ficolinA真核表达载体及pGEXKGficolinA原核表达载体, 并在大肠杆菌中获得高效的表达, 表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致。并且成功制备了多克隆抗体。结论: 成功地构建了重组表达载体pVAX1ficolinA及pGEXKGficolinA, 并在E.coli BL21中表达了ficolinA蛋白, 为下一步研究小鼠ficolinA的功能奠定了基础。 【关键词】 小鼠ficolinA; 基因克隆; 蛋白表达; 抗体 纤维胶凝蛋白（ficolin）存在于多种动物和人体内, 组织分布广泛。作为一种转化生长因子1结合蛋白（TGFβ）从猪的子宫内膜中分离出来。Ficolin 与甘露聚糖结合凝集素（mannanbinding lectin, MBL）具有类似的结构和功能, 属于补体凝集素的一种。它们是天然免疫中一种重要的“一线防御”分子, 也是继胶原凝素之后的一种重要的糖类模式识别分子［7］。Ficolin的一级结构和空间结构肽链跟MBL和补体蛋白C1q分子相似。研究显示: ficolin很可能像C1q分子和胶凝素那样, 通过其球形的“头部”与病原体的糖类结合位点结合, 而其胶原样区介导调理吞噬［1, 2］。Ficolin介导的调理吞噬可能通过两条途径进行: 一是与病原体结合后激活MASP, 后者裂解补体产生C3b, C4b等调理素, 以促进吞噬细胞内吞作用。二是直接与吞噬细胞表面的ficolin特异性受体结合, 从而拉进了病原体与吞噬细胞之间的距离, 利于病原体被吞噬和清除［7］。鼠ficolinA与猪的ficolin、 人ficolin1、 ficolin2氨基酸序列的同源性分别是60.2、 59.8、 59.8和59.6%。鼠ficolinA在肝脏和脾脏中高表达［5, 6］。我们成功克隆了小鼠ficolinA（mouse ficolinA）基因, 构建在真核及原核表达载体上, 纯化了在大肠杆菌中过度表达ficolinA蛋白, 并制备其抗体, 为进一步研究ficolinA蛋白的功能奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 孕C57BL/6小鼠（SPF 3级 , 雌性）购自武汉大学动物中心, 真核表达载体pVAX1, 原核表达载体pGEXKG, 大肠杆菌E.coli DH5α和E.coli BL21菌株均由本实验室保存。各种限制性内切酶、 T4 DNA连接酶、 蛋白质质量标准购自MBI公司, 异丙基硫代βD半乳糖甘(IPTG)为Amresco 公司产品, GlutathioneSepharose 4B 亲和层析柱购自Pharmacia公司。兔抗GST抗体由本室制备, 辣根过氧化物酶标记羊抗兔IG购自Promega公司.Generacerkit购于Invitrogen公司。引物的设计与合成: 根据Genebank的ficolinA基因序列(031348)设计引物, 上游引物为: 5′GGATCATATGCAGTGGCCTACGC3′, 含有BamHⅠ酶切位点; 下游引物为: 5′CAAGCTTGAGACTGGGGCACCTTA3′, 含有EcoR I 酶切位点.引物由上海生工合成。 1.2 方法 1.2.1 目的基因的扩增与纯化 从出生1周以内的C57小鼠肝脏中提取总RNA, 运用GeneRacer试剂盒进行逆转录PCR, 得到小鼠ficolinA cDNA后, 采用上述引物从ficolinA基因起始密码子处开始进行PCR扩增, 并使ficolinA基因与GST基因处于同一阅读编码框架.扩增反应的条件为: 95℃预变性3 min, 以95℃变性50 s, 55℃退火36 s, 72℃延伸1 min, 22个循环后, 再于72℃延伸10 m