T617细胞培养上清中肿瘤蛋白P185表达.doc

T617细胞培养上清中肿瘤蛋白P185表达 　 作者：王弦, 谢小强, 曹亮, 徐振山, 宋礼华 【摘要】 目的: 从转染Her2/neu基因的T617细胞上清中纯化p185蛋白, 研究其免疫原性和探究其在血清学诊断中应用的可能性。方法: 采用溴化氰活化的Sepharose 4B为基质, 通过交联A18 mAb, 用亲和层析的技术纯化p185 蛋白。将收集的T617细胞上清循环过亲和层析柱, 经梯度盐溶液解离与抗体结合的p185 蛋白, 收集到蛋白洗脱峰, 浓缩后用ELISA检测p185的免疫反应性, 并经SDSPAGE和Western blot 进一步鉴定。结果: ELISA检测p185保持了良好的与抗体反应活性, SDSPAGE和Western blot进一步证实纯化蛋白的相对分子质量(Mr)约为185 000, 是HER2/neu编码的肿瘤抗原。结论: 从转基因细胞上清中成功获取p185肿瘤抗原, 可进一步用于乳腺癌的实验室诊断研究。 【关键词】 HER2/neu; 单克隆抗体; 肿瘤蛋白; 免疫亲和层析 HER2/neu基因, 又名cerbB2, 定位于人染色体17q21, 编码相对分子质量(Mr)约为185 000的跨膜糖蛋白(p185), p185包含1225个氨基酸残基, 由信号肽、 胞外区、 跨膜区及胞内区4个部分组成, 在乳腺、 卵巢、 肺、 胃、 前列腺等10余种癌症中均显示部分患者有过量表达, 作为一个重要的肿瘤表面标记蛋白, 尤其对乳腺癌, 已被国际公认是重要的临床指标。目前国内外已有上市的免疫组化试剂盒和药物用于检测和靶向治疗乳腺癌, 为了进一步探索诊断乳腺癌新方法和建立相关的诊断标准, 我们利用亲和层析方法从T617细胞上清中提取和纯化了细胞所分泌的肿瘤蛋白p185, 初步解决了用基因工程方法较难表达p185的问题, 为下一阶段实验奠定了基础。 1 材料和方法 1.1 材料 T617细胞株为转染Her2/neu基因的NIH/3T3细胞株, 其膜表面高表达p185; A18细胞株和A21细胞株为稳定分泌抗p185蛋白的单克隆抗体（mAb）杂交瘤细胞, mAb亚类均为IgG1［1］。上述细胞株均由中国科学技术大学生命科学院刘兢教授惠赠。雌性BALB/c小鼠, 由安徽安科公司提供, 用于制备mAb腹水。DMEM购自Gibco公司; 小牛血清购自杭州四季青公司; 溴化氰活化的Sepharose 4B购自Sigma公司; Model 550型酶标仪购自Bio Rad公司; UV1型紫外检测仪购自Pharmacia公司。 1.2 方法 1.2.1 A18, A21杂交瘤腹水的制备和纯化 无菌培养收集A18和A21细胞［2］, 分别以5×106个细胞接种注射降植烷的BALB/c小鼠腹腔, 10 d后可获富含抗体的腹水, 收集腹水, 得A18 腹水11.5 mL, A21腹水30 mL。按照IgG1抗体纯化方法: 辛酸－硫酸铵盐析法进行纯化。经离心、 稀释后, 加辛酸除去非IgG蛋白后, 经50%饱和硫酸铵沉淀, 透析后获粗制抗体。经紫外测得A18蛋白含量约为9.6 g/L, A21蛋白含量约为16 g/L。 1.2.2 A18酶结合物的制备 取0.5 mL HRP溶液（5.0 mg HRP溶于0.5 mL H2O中）加0.5 mL过碘酸钠溶液（6.4 mg过碘酸钠溶于0.5 mL H2O中）, 4℃搅拌30 min; 加0.5 mL乙二醇溶液（4.5 μL乙二醇溶于0.5 mL H2O中）, 室温30 min; 加1 mL A18（5 g/L）对2 L碳酸钠缓冲液（3.18 g碳酸钠, 5.88 g碳酸氢钠溶于2 L H2O中, pH9.5）4℃透析过夜; 取透析液2 mL加0.17 mL硼氢化钠溶液（5 mg硼氢化钠溶于1 mL H2O中）4℃搅拌2 h; 滴加2.2 mL饱和硫铵溶液, 4℃搅拌, 0.5 h后静置3 h; 12 000 r/min, 离心10 min, 沉淀以2.0 mL PBS悬浮, 对2.5 L PBS透析过夜。棋盘滴定测其工作浓度。 1.2.3 亲和层析柱的制备 按CNBractivated Sepharose 4B说明书中的方法, 制备2 mL 湿胶（1 g干粉可获得3.5 mL湿胶）, 每mL湿胶交联15 mg A18, 4℃过夜。以 Lowry法检测偶联前后偶联液中A18的浓度, 并计算mAb的结合率。 1.2.4 T617细胞上清的收集、 亲和层析纯化和浓缩 将收集的T617细胞上清约1 L过亲和层析柱, 流出液循环上样, 4℃过夜。先用PBST洗去未结合的蛋白,