丹参酮ⅡA对高糖培养大鼠血管平滑肌细胞p38MAPK信号通路影响.doc

丹参酮ⅡA对高糖培养大鼠血管平滑肌细胞p38MAPK信号通路影响 　【摘要】 目的:观察丹参酮ⅡA对高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响，分析该作用与氧化应激以及丝裂原活化蛋白激酶p38（p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK）信号通路的关系。方法：取第3代原代培养的大鼠血管平滑肌细胞建立高糖诱导细胞增殖模型，实验分为正常对照组、高糖组和丹参酮ⅡA组，BrdU掺入法测定血管平滑肌细胞的DNA合成水平；黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法分别测定细胞培养上清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量；免疫印迹法（Western blot）检测磷酸化p38MAPK蛋白表达。结果：高糖诱导的血管平滑肌细胞呈快速增殖状态，在10～25 mmol·L-1间增殖效应呈剂量依赖性；丹参酮ⅡA能抑制高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖，提高高糖培养的细胞中SOD水平，降低MDA含量，减少p-p38MAPK蛋白的表达。结论:丹参酮ⅡA抑制高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖，这可能与其能减少血管平滑肌细胞中的氧自由基，抑制p38MAPK信号通路有关。 【关键词】 丹参酮ⅡA； 高糖； 血管平滑肌细胞； 氧化应激； 丝裂原活化蛋白激酶p38 糖尿病是一种慢性代谢障碍性疾病，其发病率在世界范围内逐年增加。糖尿病并发症尤其是心脑血管并发症是糖尿病患者致残和早死的主要原因。血管平滑肌细胞的增殖与聚集是慢性血管病变的主要发病机制［1］。丹参酮ⅡA是丹参的脂溶性有效单体，对动脉粥样硬化具有较好的疗效,但是其作用机制研究较少。本实验中，建立高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖模型，用丹参酮Ⅱ干预细胞，观察其对高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖氧化应激水平和丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)信号通路的影响，为丹参酮ⅡA的临床应用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 动物和材料 雄性SD大鼠，体重150～200 g，由东南大学医学院动物实验中心提供，DMEM/F12购自Gibco公司，胰蛋白酶购自 AMRESCO公司,胎牛血清与新生牛血清均购自兰州明海生物工程公司，BrdU标记及检测试剂盒购自Roche公司,超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，磷酸化p38MAPK抗体购自Cell Signal Technology，二抗购自上海晶美生物公司。 1.2 大鼠血管平滑肌细胞的原代培养 正常大鼠颈椎脱臼处死,在无菌环境中迅速取出胸主动脉,放入冷 D-Hanks液中冲洗3遍。剥去血管外膜,再将血管纵行剖开,去除内膜,将中膜血管放入盛有含培养液的平皿中,剪成1.5～2.0 mm3的小块并均匀地平铺在培养瓶内,加入含血清的DMEM/ F12,放入37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中以贴壁面向上静置4～6 h,将培养瓶轻轻地翻转,使得组织块浸在培养液中,静置培养4～7 d。 1.3 BrdU掺入法测定细胞增殖 将细胞用胰酶消化进行传代培养，取第3代细胞进行实验。实验分组如下：正常对照组,培养液含5.5 mmol·L-1葡萄糖；高糖组,培养液分别含10、20、25 mmol·L-1的葡萄糖；丹参酮ⅡA组,培养液含25 mmol·L-1的葡萄糖和0.5 mg·L-1的丹参酮ⅡA。将以上各种培养液干预细胞置于96孔培养板中进行培养,48 h后弃去培养液，每孔加入BrdU 10 μl标记细胞，37 ℃孵育2 h，弃培养液；经60 ℃干燥1 h，每孔加FixDenat固定液200 μl，25 ℃孵育30 min；弃固定液加入Anti-BrdU-POD液室温放置90 min；弃去抗体加洗涤工作液250 μl洗细胞，重复3次；弃去液体，每孔加入底物溶液100 μl，室温放置5～30 min，在5、10、20 min时以370 nm的波长测定吸光度值，向每孔中加 1 mol·L-1H2SO4 25 μl，在5 min内于450 nm波长处检测吸光度值。 1.4 细胞培养上清液SOD、MDA含量的检测 消化收集第3代细胞，调整细胞密度至5×105ml-1，接种于24孔板，每孔1 ml，待细胞生长融合至60％后同步化12 h，实验分为正常对照组（培养液含5.5 mmol·L-1葡萄糖）、高糖组（培养液含25 mmol·L-1的葡萄糖）和丹参酮ⅡA组（培养液含25 mmol·L-1的葡萄糖和0.5 mg·L-1的丹参酮ⅡA），干预48 h后分别吸取各孔细胞培养液，置EP管中待用。SOD、MDA的测定按试剂盒说明书进行。 1.5 免疫印迹法检测p-p38MAPK蛋白表达 消化收集第3代细胞，调整细胞密度至5×105ml-1，接种于6孔板，每孔1 ml，待细胞生长融合至60％后同步化12 h，