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壁虎脊髓细胞原代培养及形态学观察 　 作者：顾芸，刘梅，刘炎，顾晓松 【摘要】 目的：探讨壁虎脊髓细胞分离及培养方法。方法：分离壁虎脊髓，消化接种于细胞培养瓶中, 采用不同渗透压、pH值、温度、消化、粘附基质的培养条件。结果：5％CO2、饱和湿度培养条件，在添加10％FBS的DMEM/F12培养基（渗透压200～260mmol/kg，pH7.2）中，获得了不同细胞类型的细胞，其中包括神经元样和胶质细胞样细胞，神经元样细胞NF染色阳性，GFAP染色阴性，而胶质样细胞GFAP染色阳性。结论：建立了壁虎脊髓细胞分离及培养方法，为壁虎脊髓再生过程中基因的研究提供细胞水平功能平台。 【关键词】 细胞原代培养；传代培养；脊髓损伤；壁虎 　脊髓损伤是目前神经科学和其他相关学科研究的热点之一。传统观念认为，成体中枢神经系统损伤不能再生，脊髓损伤后由于局部缺乏合适的微环境，损伤的神经元无法再生、修复。低等脊椎动物的脊髓有内在的再生能力[1]，但其再生的机制仍然是悬而未决的问题。爬行动物壁虎能够断尾再生，最明显的特征可能是脊髓的分化潜能[2]。因此，我们试图通过建立壁虎细胞培养的体外研究平台，从细胞学水平研究其再生机制，以期为脊髓损伤的修复提供依据。首次探讨了脊髓细胞的取材、分离及培养方法，并对细胞的形态学进行了研究，为后续的脊髓再生机制和基因功能研究打下基础。 　　1 材料和方法 　　1．1 动物来源 实验用动物捕获自野生环境，经鉴定为多疣壁虎（Gekko japonicus）。选择成年正常壁虎4只，体重3.0±0.5g，全长约10cm，无断尾或其他损伤，雌雄不限。 　　1．2 主要试剂 DMEM/F12培养基、胰酶、多聚左旋赖氨酸(Gibco)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料研究所)；兔抗GFAP多克隆抗体（DakoCytomation 公司)；兔抗NF200多克隆抗体、FITC标记羊抗兔二抗、TRITC标记羊抗兔二抗、Hoechst 33342（Sigma 公司）；其他试剂为国产分析纯。 　　1．3 方法 　　1．3．1 培养基组成 DMEM/F12培养基，调渗透压为200～260mmol/kg，pH 7.2。添加10％胎牛血清，1％双抗（青霉素和链霉素各100 IU／L）和1％谷氨酰胺。 　　1．3．2 原代细胞培养 成年多疣壁虎4只，冰上麻醉，常规碘伏消毒皮肤后，去背部皮肤、肌肉后，用显微持针器将椎骨完全打开，将脊髓完整取下，立即置于预冷的DMEM抗生素液中(青霉素和链霉素各100IU／L)，在解剖镜下将膜剥去，按下面的方法准备培养。 用含有抗生素的DMEM液将脊髓充分清洗3遍，用眼科剪剪碎，加入0.25％胰酶，在30℃孵育箱中孵育l5～20 min；完全培养液终止消化，制成细胞悬液。1000rpm/min离心10min后去除上清液，加完全培养液4.0～4.5 ml，重悬细胞，调整细胞密度为1×105，种植于已用多聚赖氨酸包被的25cm2的细胞培养瓶内，于30°C，5％ CO2，饱和湿度条件下培养，每天观察细胞形态。 　　1．3．3 传代细胞培养 待细胞长成致密单层后即可进行细胞传代，弃去生长液，以0.25%胰酶消化，待消化完全后弃去胰酶，加适量新鲜生长液，反复吹打，制成单细胞悬液，然后以1∶2或1∶3传代，30℃培养，待长成致密单层时，再按上述方法传代。 　　1．3．4 荧光免疫细胞化学分析 培养细胞胰酶消化后，种于浓度为0.05mol/L 的多聚赖氨酸包被过的圆玻片上，培养24h后，经4% 多聚甲醛室温固定30min, 0.01mol/L PBS洗涤10min×3次、37℃条件下封闭60min后( 封闭液为含10%羊血清、0.1% Triton X-100 的0.01mol/L PBS液)，分别滴加一抗（兔抗GFAP，1∶500稀释；兔抗NF200，1∶200稀释），4℃放置过夜，0.01mol/L PBS洗涤10min×3次后，分别滴加FITC标记羊抗兔二抗（1∶1000稀释）；TRITC标记羊抗兔二抗(1∶1000稀释），以Hoechst（5μg/ml）标记细胞核，室温、避光放置1h，0.01mol/L PBS洗涤10min×3次，激光共聚焦显微镜观察免疫荧光细胞化学检测结果。 　　2 结果 　　2．1 细胞形态学观察 壁虎的脊髓细胞原代培养1周，只有少量细胞贴壁，培养瓶内可见到大量的细胞碎片，团块状絮状物及成团状或散在的细胞，该部分贴壁细胞，呈扁多角形、圆形或多边形。这些细胞胞核清楚、胞质清亮，细胞间充满黑色颗粒，被称作“窝形”细胞。 培养2至3周后，细胞开始大量贴壁生长，除可观察到较多的细胞碎片、桑椹样堆积的圆形细胞外，逐渐出现一些纺锤形细胞；这些细胞先伸出一根突起，然后再伸出第二根突起，形成双极形细胞或梭形细胞