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大鼠近端肾小管上皮细胞原代培养及鉴定 　 作者：王光兰 陈爽 张丽红 范 颖 石英爱 孙华君 刘晓会 吴珊 【摘要】 目的 建立较好的大鼠近端肾小管上皮细胞原代培养模型。方法 无菌取Wistar大鼠肾脏，取皮质剪碎，经Ⅰ型胶原酶消化和45%Percoll连续密度梯度离心进行纯化，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基原代培养并传代，观察细胞形态并以免疫细胞化学染色及酶化学染色鉴定。结果 培养4～5 d细胞融合成单层，呈典型的鹅卵石样，细胞角蛋白18及碱性磷酸酶染色均呈阳性,细胞可传2～3代。结论 此法可在短期获得数量较多、重复性好的近端肾小管上皮细胞，为体外研究肾小管细胞的病变提供了实验平台。 【关键词】 近端肾小管上皮细胞;原代培养;大鼠 　　【Abstract】 Objective To establish the better model for primary culture of rat proximal tubule epithelial cells(PTCs).Methods Wistar rats kidney were sterile taken out, then the cortex was separated and shredded, purified by collagenase Ⅰdigestion and 45% percoll discontinuous density gradient centrifugation, cultured and passaged by DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, identified by morphology, immunocytochemistry staining and enzyme staining.Results After 4 to 5 days,the cells were inosculated into a single layer and showed the typical cobblestonelike appearance.The cytokeratin18 and alkaline phosphatase staining were positive， the cells could be passed 2～3 generation.Conclusions This method can yield large quantity and good repeatability PTCs in short term，those cells can provide an experimental platform for the research of pathological changes and lesions. 　　【Key words】 Proximal tubule epithelial cells;Primary cultrue;Rat 　 肾脏纤维化是多种肾脏疾病发展至肾衰竭终末期的共同表现，肌成纤维细胞在此过程中发挥重要作用。目前，肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化是纤维化过程中成纤维细胞和肌成纤维细胞的来源之一〔1〕。因此，建立良好的近端肾小管上皮细胞的体外培养模型，对于肾小管上皮细胞疾病的研究十分重要，本实验旨在探讨大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定的方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要材料、试剂 体重180～220 g的雄性Wistar大鼠(吉林大学基础医学院实验动物中心);Ⅰ型胶原酶(Sigma);优级胎牛血清(Hyclone);DMEM/F12培养基(Gibco);细胞角蛋白18(CK18)多克隆抗体(北京博奥森公司);SP试剂盒、DAB试剂盒(福州迈新公司)。 　　1.2 肾小管上皮细胞的分离培养 大鼠实验前12 h禁食，自由进水。颈椎脱臼处死后，75%酒精浸泡5 min，无菌取双肾，置于冷PBS中，去除肾蒂及包膜，切取薄层肾皮质，剪碎至1 mm3大小，PBS洗3遍，离心800 r/min,5 min;所得沉淀加入终浓度为1 g/L的Ⅰ型胶原酶，37℃振荡消化30 min，将消化后的组织碎块转移至80目不锈钢网上，过滤、研磨并用DMEM/F12培养基冲洗;网下液体再经200目筛网过滤后，1 000 r/min离心5 min。取沉淀用45% Percoll分离液25 ml重悬制备细胞悬液。将细胞悬液小心铺于含5 ml 100% Percoll分离液的离心管中，14 000 r/min，4℃条件下离心25 min可见液体分层。吸取近管底第2层细胞悬液，即为近端肾小管节段及其游离的上皮细胞。DMEM/F12