大肠癌及正常大肠粘膜中新分化相关基因的表达.pdfVIP

中文摘要 f l前 言 、～ 大肠癌的发生和发展是多基因参与，多阶段进行的过程。正常 大肠粘膜通过去分化和异型增生，形成腺瘤、原位癌，进而侵袭和 转移。此过程涉及多种原癌基因和抑癌基因的异常，尤其是抑癌基 因的失活，在大肠癌的发生演进过程中起着更重要的作用。肿瘤的 多基因参与模式以及细胞遗传学的研究表明，大肠癌的发生显然 不局限于已知的一些原癌基因和抑癌基因，还有许多未知的相关 基因改变。 SBA2是细胞生物学教研室应用mRNA差异显示和RACE of cDNA amplificationends)技术，在丁酸钠诱导的人低 (Rapid 分化大肠癌细胞系CloneA中筛选出来的一个新的大肠癌分化相 关基因。其cDNA全长序列由2470个碱基组成，已被美国Gen— k 白质，分子量为44．4Da，与细胞因子信号抑制蛋白家族(Sup— of pressorCytokine socs蛋白家族的一个新成员，参与细胞信号转导的负调控。如探 讨其在大肠癌发生发展中的作用，本实验建立了半定量RT—PCR 方法，探讨RT—PCR反应的扩增动力学，在mRNA水平上对该分 化相关基因在四种不同分化程度的人大肠癌细胞系和30例大肠 癌组织及同一患者的正常大肠粘膜中的表达情况作对比研究，并 且结合临床资料，以避一步了解其生物学功能。 产验材料与方法 本实验建立了半定量RT—PCR方法，探讨了反应的扩增动力 学，检测新大肠癌分化相关基因SBA2在四种不同分化程度的人 大肠癌细胞系(低分化大肠癌细胞系CloneA、中分化大肠癌细胞 癌组织及同一患者正常大肠粘膜中的表达情况。用2ug总RNA 逆转录后，在22—26个循环内，目的基因SBA2与内部参照肛 actin均在线性扩增范围内；并且二者在指数扩增阶段的扩增效率 效率无明显影响，因此可以作为内部参照标化每一样品中目的基 cDNA 因的扩增。逆转录产物的倍比稀释表明2．5ul PCR扩增后 产量最高。因此，选择2．5ul逆转录产物进行24个循环的PCR扩 增，作为半定量RT—PCR的最适参数。 实验结果 30例大肠癌组织及同一患者的正常大肠粘膜RT—PCR结 mRNA的相对表达水 果，经电泳成像分析系统扫描，计算SBA2 平。两组方差不具有齐同性，经组间计量资料的秩和检验 予同一患者的正常大肠粘膜(Po．01)。其中正常大肠粘膜SBA2 mRNA表达水平是大肠癌1．5倍以上者24例，占80％(24／30)； 2．0倍以上者12例，占40％(12／30)。多个方差的齐性检验 (Bartlett检验)表明不同分化组方差满足齐性条件，经多组均数 的两两比较(q检验)，高分化组(O．384士0．0238)与中分化组(0． 化组有显著性差异(o．01P0．05)。SBA2mRNA在人低分化 大肠癌细胞系CloneA的表达水平最低；在人高分化大肠癌细胞 ·2· 平大致相同，并且皆高于在CloneA中的表达水平。收集的9例淋 mRNA表达水平明显低 巴结转移的大肠癌患者中，有7例SBA2 于正常大肠粘膜，占77．77％；而2l例淋巴结转移阴性患者中，只 05)。 讨 论 RNA的定量分析是研究基因表达和基因词控机制的重要途 是一个指数增长过程。但实际上扩增反应的效率低于100％；在某 一恒定的反应效率下，产物的产量仅在有限的循环次数内呈指数 增长，此后停止指数增长，直至出现一个平台。而反应效率受多种 因素的影响，包括引物和扩增序列的特性，组分的浓度以及PCR 反应温度等。这些因素都限制了对mRNA起始含量进行直接和