zj基因工程第3章(载体).ppt

基因工程载体 载体概述 质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DNA 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 人造染色体载体 1 什么是载体？ 载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。 3 载体应具备的条件 ①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制。 ②载体都具有合适的筛选遗传标记。 ③载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。 4 载体的分类 克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。 从表达所用的受体细胞，又可分为原核细胞和真核细胞载体。 从功能上又可分为测序载体、克隆-转录载体和基因调控报告载体等多功能载体。 1 质粒的生物学特征 质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子 质粒常见于原核细菌和真菌中 绝大多数的质粒是DNA型的 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA 质粒DNA的分子量范围：1-300kb 1 质粒的生物学特征 质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒1-3拷贝 stringent plasmid 松弛型复制控制的质粒10-200拷贝 Stringent plasmid 质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制——质粒DNA复 制启动控制 质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制——质粒DNA复制启动控制 1 质粒的生物学特征 质粒的可转移性 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员 1 质粒的生物学特征 携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子等 有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具 有重要意义 1 质粒的生物学特征 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 质粒的不相容性：分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自已的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。 2 理想质粒载体的必备条件 1、具有较小的分子质量和较高的拷贝数 2、具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点。 3、具有两种以上的选择标记基因 4、缺失mob基因。 5、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达 3 质粒载体的构建 3 质粒载体的构建 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的： pSC101 8.8kb;拷贝数5 ;四环素抗性标记基因 Tcr ColE1 6.5kb;拷贝数20-30;大肠杆菌内毒素标记基因E1 RSF2124 ColE1衍生质粒;氨苄青霉素抗性标记基因Apr 质粒载体设计和构建遵循的原则 4 常用的质粒载体类型 4.1 克隆质粒载体 质粒克隆载体的用途： ①用于保存和扩增片段小于2kb的目的基因。 ②构建cDNA文库。 ③可用于目的基因的测序。 ④作为核酸杂交时探针的来源。由于现在核酸标记方法的成熟，将质粒载体上的目的基因切下并标记即可作为核酸杂交探针，现在的DNA杂交探针大部分来源于质粒。 4 常用的质粒载体类型 4.2 表达质