急性分离大鼠心室肌细胞Ca2+电流及细胞内Ca2+浓度.docVIP

急性分离大鼠心室肌细胞Ca2+电流及细胞内Ca2+浓度 　【摘要】 目的在急性分离SD大鼠心室肌细胞上,检测Ca2+电流(ICa)和Ca2+浓度\[Ca2+\]i的变化。方法改良Langendroff法,用含胶原酶I(1750 U/mL)和蛋白酶ⅩⅣ(0.28 mg/mL)的无Ca2+台氏液经大鼠主动脉循环灌流法,急性分离大鼠心室肌细胞;采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞的ICa,动态细胞荧光成像技术检测心室肌细胞\[Ca2+\]i的变化。结果在20 min内新鲜分离大鼠心室肌细胞,全细胞膜片钳技术可记录电刺激引起心室肌细胞的ICa,1 μmol/L异丙肾上腺素可显著增加ICa;并观察到心室肌细胞\[Ca2+\]i以及电刺激增强\[Ca2+\]i的效应。结论大鼠心室肌细胞急性分离方法简便实用,所分离的心室肌细胞形态和功能正常,适用全细胞膜片钳和动态细胞荧光成像技术检测实验。 【关键词】 心室 心肌 钙 钙通道 膜化钳术 Fura2 成年大鼠心室肌细胞的急性分离是心肌功能研究的常用技术,以往的分离方法步骤多,时间较长,消化酶用量较大[13]。笔者介绍一种更为简便实用的改良Langendroff法,经主动脉消化酶恒流循环灌流的成年大鼠心室肌细胞的急性分离技术,并应用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞的Ca2+电流(ICa)以及异丙肾上腺素对ICa的影响以检测其电生理学特性,通过观察电刺激对心室肌细胞胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响实验,介绍细胞动态荧光成像系统的使用方法。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1动物健康SD大鼠,雄性,体质量250~300 g(上海斯莱克实验动物有限公司)。 1.1.2主要试剂与仪器胶原酶I(1750 U/mL,美国Gibicol公司),蛋白酶ⅩⅣ(0.28 mg/mL,美国Sigma公司)。河豚毒(TTX,美国Calbiochen公司)。异丙肾上腺素(Iso,美国Sigma公司)。Fura2AM，20%Pluronic酸(美国Molucular Probe公司)。膜片钳放大器(Axopatch200B，美国Axon公司)，电流信号用Clampex 8.2和Clampfit 8.2软件(美国Axon公司)记录和分析。动态细胞荧光成像系统组成:DeltaRAM X高速荧光光源(美国PTI公司),CCD(电荷藕合器件图像传感器（Charge Coupled device,CCD,CoolSnap ES,德国Roper Scientific公司),光电倍增管(PMT,美国PTI公司),荧光图像或荧光强度分别用ImageMaster 5.0和FeliX 32软件记录与分析(美国PTI公司)。倒置显微镜(T2000U,日本Nikon公司),超级荧光型油镜(CFI S Fluor 40×油镜,数值孔径为1.3,日本Nikon公司)。 1.2方法 1.2.1急性心室肌细胞分离[4]大鼠腹腔注射肝素(250 IU/100 g),5 min后氨基甲酸乙酯(1 g/kg)腹腔麻醉。迅速开胸摘取心脏,置盛有37 ℃预热的台氏液100 mL的培养皿中。台氏液成分如下(mmol/L):137 NaCl,2 CaCl2,5.4 KCl,1 MgCl2,10 glucose和10 Hepes(pH 7.4)。清洗血液,剪除残余肺叶与脂肪组织,迅速行主动脉插管。将心脏悬挂于Langendroff灌流装置上,结扎主动脉于插管上。采用恒流泵(6 mL/min)经主动脉插管逆向灌流冠脉血管床,先用无Ca2+台氏液灌流3~5 min,冲洗心室内残留的血液,换用含胶原酶I 20 mL和蛋白酶ⅩⅣ的无Ca2+台氏液循环灌流12 min,最后用含0.2 mmol/L Ca2+台氏液灌流5 min冲洗消化酶,剪下心室,放入37 ℃预热的含0.2 mmol/L Ca2+台氏液20 mL的培养皿中,用眼科剪剪开心室,并将心室在溶液中轻轻晃动以分散已解离的心室肌细胞。上述过程使用的灌流液需通入纯氧充分饱和,分离所得的心室肌细胞在室温(22 ℃)0.2 mmol/L Ca2+台氏液中可存活8~10 h。实验时用吸管把心室肌细胞混悬液加入含2 mmol/L Ca2+台氏液培养皿中,5 min后心室肌细胞即可贴壁,进行全细胞膜片钳记录,或细胞Ca2+浓度检测。 1.2.2全细胞膜片钳技术检测电刺激引起ICa方法参考文献[4]。细胞外液使用台氏液,加入10 μmol/L TTX以阻断Na+通道。电极经拉制和热刨光后,其尖端的电阻为3~5 MΩ,电极内液成分为(mmol/L):105 CsCl,10 NaCl,5 MgATP,10 Hepes,20 TEACl,4 EGTA和2 CaCl2(pH 7.2)。电信号经5 kHz滤波