环扩增法检测小矮腥黑穗菌.pdfVIP

中国农业科学 2009,42(10):3493-3500 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.10.014 超分支滚环扩增法检测小麦矮腥黑穗菌 1 1 2 2 1 1 1 蔡 俊 ，殷幼平 ，葛建军 ，陈洪俊 ，黄冠军 ，张雯迪 ，王中康  1 2 （重庆大学生物工程学院基因工程研究中心/重庆市功能基因与调控技术重点实验室，重庆 400030 ； 中国检验检疫科学院动植物检疫研究所， 北京 100029 ） 摘要：【目的】建立小麦矮腥黑穗病菌（ Tilletia controversa Kühn，TCK）的超分支滚环扩增（hyper- branched rolling cycle amplification，HRCA）检测体系，为小麦矮腥黑穗病的鉴定以及早期诊断提供了一种 新的稳定、可靠的检测技术。【方法】锁式探针包含一个公共连接序列和在探针两端与靶DNA序列互补的 2个序列。 根据TCK的差异序列设计锁式探针两端序列，以此为基础建立了TCK超分支滚环扩增反应体系。以优化的HRCA反 应条件为基础，确定检测体系的特异性和灵敏度。比较HRCA体系和常规PCR体系的性能，并利用这2种体系对来 自中国出入检验检疫局截获的51个小麦样品进行了验证检测。【结果】HRCA体系能专一地检出小麦矮腥黑穗菌的 -1 DNA靶带，而TCT、TCL等近源种及健康小麦样品都不能扩增。HRCA检测 TCK靶序列质粒DNA的下限为1 fg· μl ， -1 检测基因组 DNA 的下限为 10 pg· μl ，检测灵敏度比常规 PCR 检测体系高 10 倍。HRCA 检测体系具有很好的特异 性、灵敏度和准确性，更适合于TCK的检测及鉴定。【结论】稳定、灵敏、特异的小麦矮腥黑穗菌的HRCA检测体 系的建立，为小麦矮腥黑穗病的早期诊断及其近源种的多靶标检测提供了同步检测技术。 关键词：小麦矮腥黑穗病；超分支滚环扩增；锁式探针；检测 Detection of Tilletia controversa with HRCA Approach 1 1 2 2 1 1 CAI Jun , YIN You-ping , GE Jian-jun , CHEN Hong-jun , HUANG Guan-jun , ZHANG Wen-di , 1 WANG Zhong-kang 1 (