修饰动物模型的建立和应用.ppt

第二十二章 常用分子生物学技术的原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application 第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization Blotting Technology 核酸分子杂交的原理 带有某种标记的核酸单链作为探针，在一定条件下， 按碱基互补配对原则与互补的核酸单链退火形成双链杂交体， 鉴定靶序列的存在、分子大小或进行靶序列的相对定量分析。 核酸分子杂交的杂交动力学 核酸分子杂交 核心序列形成 自发过程 探针的来源 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 核酸杂交技术 （一）Southern Blot 原理 斑点印迹杂交(Dot blot) 斑点印迹 优点简单、迅速；核酸粗提、多样品检测 缺点不确定分子量、特异性不高，假阳性 原位杂交 （In Situ hybridization） 标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交。 1969, Pardue --爪蟾核糖体基因探针 1970, Orth 兔乳头状瘤病毒cDNA探针 Western Blot 原理 操作过程 SDS电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜） 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 洗涤 显色或化学发光显影 注意的问题 蛋白质电泳 常用SDS非变性PAGE Tris-Tricine胶中电泳 DNA芯片: （Bio-chip、DNA arrays、Oligonucleotide microchip) 特点：高度并行性，多样性，微型化和自动化。 DNA micrarray robot enclosed in a temperature and humidity controlled environment. Research Use——From Sequence to function 计算Ratio 值 (= Cy3/Cy5) 在 0.5-2.0 之外的定义为在两样本中有明显差异表达。进而获取初步功能信息。 Clustering DNA芯片技术的主要应用 ① 分析基因组、发现新基因 ② 基因表达的研究 ③ DNA序列分析 ④ 基因诊断 ⑤ 基因药物设计 第 二 节 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction 三、几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 第 三 节 核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis 基 因 文 库Gene Library 疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes （三）非定位候选基因克隆策略 由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。 第 六 节遗传修饰动物模型的建立及应用 核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。 四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用 建立动物模型 ① 单基因决定疾病模型 基因剔除 获得性突变(gain-of-function mutation) ② 多基因决定疾病模型 定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。 （一）功能性克隆 应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。 克隆方式 ① 利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库； ② 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。 功能互补试验 (functional complementation assay) 利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。 （二）定位克隆 定义 从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。 （四）定位候选基因克隆策略 当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。 The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 转基因技术 采用基因转