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模拟生产工艺制作大肠杆菌苗课堂改革 　　摘要：随着高职教育课堂形式改革的不断深入，理实一体化课堂形式已成为培养高职学生的主要运行模式。大肠杆菌疫苗的制作是《生物药物制备技术课程》的主修内容，具有实践性和应用性强的特点，为了使菌苗制作的工序过程更接近生产实际，让学生“零距离”体验生产岗位的操作标准，掌握操作过程的技能与技巧，经过多年来的探索和实践，总结出模拟生产工艺制作大肠杆菌铝胶灭活苗的一些经验供相关学者参考。 　　关键词：模似生产；流程；大肠杆菌 　　中图分类号：G71 文献标识码：A 　　文章编号：1005-913X（2017）01-0143-02 　　大肠杆菌疫苗制作的课堂教学在内容设计上，由原来的零散实验如：培养基的制作、菌种的培养、细菌的计数方法、铝胶的配制、配苗和检验等，改为模拟大肠杆菌的生产工艺流程，按照生产岗位的操作标准，以生产上的工序过程，利用理实一体化课堂教学模式，完成大肠杆菌铝胶灭活苗的制作和检验，全过程分基本知识介绍和基本技能操作两部分。 　　一、基本知识介绍 　　让学生课下复习大肠杆菌相关的理论知识，课堂上通过播放工业生产中大肠杆菌苗的视频及课件了解大肠杆菌苗的整体制作过程；同时讲清大肠杆菌每道工序操作的要点及注意事项。让学生明晰在生产岗位所要从事的工作。 　　二、基本技能操作训练 　　整个操作过程分6道工序完成。将学生分成6个小组，按工序的顺序进行实施。完成每一道工序时，按生产上的操作标准（模拟生产要求）执行，同时按要求检验每道工序作品是否合格，合格后方可执行下一道工序。 　　（一）菌种的选择与鉴定 　　可选用购买的大肠杆菌标准菌种或按常规制作血液琼脂平板或营养琼脂平板，分离培养含大肠杆菌的病料（死于大肠杆菌病的动物心血、腹水、肝渗出物、气囊附着物或正常动物的肠道内容物），经伊红美兰琼脂平板培养，挑选出黑色带金属光泽菌落；经靛基质试验、甲基红试验，结果呈阳性，VP试验，结果呈阴性；细菌经涂片、革兰氏染色、显微镜检查，结果呈中等大小革兰氏阴性（红色）的杆菌；经因子血清鉴定确定血清型后，可作为标准菌种使朋。菌种可保存在琼脂斜面中（短期使用）或采用冷冻干燥法保存（长期使用），以免发生变异。 　　（二）种子培养及菌液的制备 　　取上述大肠杆菌菌种接种于伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置37℃温箱中培养18～24 h，挑取单个典型菌落，移植于琼脂斜面中作为种子。用灭菌吸管取5 mL马丁肉汤加人大肠杆菌的琼脂斜面中，用接种环刮取下菌体，研磨稀释后倒入另一只灭菌试管中，置37%培养18～24h后，作为一级种子。将一级种子按10%的量再次接种马丁肉汤中进一步扩大培养后，做为配苗菌液。取配苗菌液少量装于灭菌试管中做菌数计数，其余菌液灭活待做配苗用（强毒细菌须在杀菌后，再行计数）。 　　（三）采用活菌计数法或比浊计数法对配苗菌液进行计数 　　活菌计数法可选用平板表面涂布法或倾注平板培养法。 　　1.活菌计数。活菌计数法是将待测菌液精确地作一系列稀释，然后吸取一定量某稀释度的菌液样品，选用适当的方法进行培养。一个活的细菌经培养后，在平板培养基上大量繁殖可形成一个肉眼可见的菌落，从长出的菌落数及稀释倍数，换算出每毫升待测菌液中的活菌数即细菌总数。 　　（1）平板表面涂布法 　　制备营养琼脂平板。用商品化的营养琼脂粉，按常规方法制作营养琼脂平板8个，用前将营养琼脂平板倒置在37℃温箱中烘干1h，使其表面的水分蒸发。取出后将其分为4组，每组2个平板，第4组为对照组。 　　稀释菌液。根据待测菌液中菌数含量的多少，在做培养之前，用普通肉汤或生理盐水将被测菌液作10倍递进稀释即10-1、10-2、10-3、10-4……。稀释方法为：取灭菌试管6～10支，分别标明稀释倍数；每支试管中加入灭菌生理盐水或肉汤9mL；另取灭菌吸管吸取待测菌液1mL，加入第1支试管中，充分混匀，稀?倍数为10-1；从第1支试管中吸取稀释菌液1mL加入到第2支试管中，充分混匀，稀释倍数为10-2，如此一直稀释到最后一支试管。 　　涂样。另取三支灭菌吸管，分别吸取后三个稀释度试管中的菌悬液0.1mL，对应加在3组营养琼脂平板上，每一个稀释度菌液接种2个平板，用灭菌L形玻璃棒将菌液涂匀。在平皿底作好与试管稀释度相同的标记。第4组作对照，加稀释液0.1mL。 　　培养。将上述各组的平板置37℃温箱中培养1～2h，使菌液渗透于培养基内，然后倒置培养24h。 　　计数。从培养箱中取出培养皿，用肉眼观察计算每个平板上的菌落数，必要时可用5-10倍放大镜观察，以免遗漏。一般选择菌落数在30～300之间的平皿用以计数，每个稀释度应取其菌落平均数，并求3个稀释度之和再取其平均值，得出每毫升待测菌液所含的活菌数。按下式计算活菌数。