5.1 DNA技术.pptVIP

DNA 技术 DNA 技术 琼脂糖凝胶电泳 PCR技术 Southern blot 双脱氧法测序 1.琼脂糖凝胶电泳 1、原理： 2、用途： 琼脂糖凝胶电泳的原理 1. DNA电泳迁移：电荷效应＋分子筛效益 （1）DNA带负电，电场中，向正极移动； （2）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷数，构型； ( 3) 线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成反比； （分子量越大，跑得越慢） 2、检测原理： （1）溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中，在紫外光照射下，发射荧光。 琼脂糖凝胶电泳用途 1. DNA分子量测定（距离－分子量） 2. 基因，克隆的鉴定（通过1完成） 3、不同长度的基因片断的分离 4、DNA浓度的测定 （荧光的强度与DNA含量成正比） 加标准分子量DNA Marker,测定分子量 加标准浓度的DNA，测定浓度 3. PCR(聚合酶链式反应) 技术 PCR扩增引物的设计 引物常规设计原则 1. 长度：１５～３7 nt, 一般２０nt左右; (仅binding , 不含接头) 2. G + C 含量４０％～６０％ 3. 避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构； 4. 引物自身不能互补（3个） 5. 引物之间不能互补（5?个） 6. 引物３端不能错配, 不能修饰，尽量不用A, 不能超过３个连续的G或C； 7. ５端可变化修饰，附加酶切位点； 8. 两引物的Tm值应比较接近； 9. 正链引物：mRNA序列照抄； 负链引物：先写出mRNA序列的互补序列，然后翻转重写。 １０．解链温度Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) [ =20 nt ] 　　　　　　　Tm = 81.5 +0.41*(GC%)-600/L [ 20nt] Tm一般５５℃～８０℃　　　［５５℃～５８℃最佳］ PCR反应中结合温度（anneaning temperature）T = Tm - 5℃ Southern blot 双脱氧法测序(Dudeoxy sequence analyses) 动画 * * PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR三步曲 变性 90～97℃ 退火 45～55℃ 延伸 72℃ 双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序 1.原理： Atkinson发现用 DNA pol 合成DNA时如在反应物中加入一定量的 2`,3`ddTTP 时，因ddT的3`碳原子不含－OH,故DNA不能延伸。 1982年Sanger 利用此原理建立了双脱氧测序法。原理和加减法相似，但不再是加一种dNTP或减一种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷，来终止聚合反应。用此法测得G4含5577bp.