人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在原核生物中的表达和制备.doc

人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在原核生物中的表达和制备 郁骁珩 于丽莉1 （上海交通大学医学院2004级法文班， 上海交通大学医学院生物化学与分子生物学教研室1上海 200025) [摘要]目的：利用基因工程技术重组构建含有人碱性成纤维细胞生长因子（human basic fibroblast growth factor , hbFGF）的质粒，并在原核生物中表达hbFGF与谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione-S-transferase ,GST）的融合蛋白。方法：用限制性内切酶将真核载体pCDNA3-bFGF中bFGF基因片段切下，重组到原核表达载体pGEX-4T-2中，构成重组GST-bFGF融合基因；将其转入大肠杆菌DH5α中，在体外用诱导剂IPTG加以诱导，表达GST-bFGF融合蛋白，并通过亲和层析纯化；用SDS和Western-Blot鉴定表达产物。结果：得到经鉴定正确的重组质粒和诱导表达的相对分子质量为44kD的融合蛋白。结论：成功构建了原核表达载体pGEX-4T-2/bFGF，并在大肠杆菌中表达了GST-bFGF融合蛋白，为下一步研究表达产物bFGF的生物活性打下了基础。 [关键词]人bFGF；重组质粒；融合蛋白；表达 Expression and Preparation of recombinant GST-hbFGF fusion protein in E.coli Yu-Xiaoheng Yu-Lili1(Department of the biochemistry and molecular biology, Faculty Medicine of Shanghai Jiaotong University) [Abstract]:Objectives:To construct a recombinant hbFGF-GST fusion gene and to express the fusion protein in E.coli expression system. Methods and Results: The fragment of hbFGF gene which comes from pcDNA3-bFGF was cloned into pGEX-4T-2 expressing vector , then transformed to E coli DH5α. The hbFGF-GST fusion protein expression was induced by IPTG. A band, whose molecular weight was approximately 44 kD ,was shown in SDS – PAGE . Then hbFGF-GST fusion protein was confirmed by Western Blot. Conclusion: We have express the recombinant human bFGF–GST fusion protein in DH5α [Key Words]: Human Basic Fibroblast growth factor；Recombinant fusion gene；Recombinant fusion protein；Escherichia coli 碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor , bFGF）含155个氨基酸残基的单链蛋白质，分子量为18kD，是一种能促进各类细胞增殖的一种蛋白质分子，具有相当广泛的生理功能。研究发现，bFGF作为一种广谱的有丝分裂原,通过与其靶细胞上的受体结合而发生作用，并通过信号转到作用于细胞核，影响RNA聚合酶I,加强核糖体的转录，刺激DNA合成增强,促使细胞的分裂与增殖[1-3]。bFGF作用的靶细胞有成纤维细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、成骨细胞、平滑肌细胞、神经原、神经胶质细胞、骨骼肌细胞、晶状体上皮细胞、角膜上皮细胞、肾上腺皮质、髓质细胞等[4]。目前已有研究证实，它在促新生血管生成、神经细胞及骨组织的再生，损伤愈合方面起着相当重要的作用[5-10]。由此可见，bFGF在临床上将会有非常广泛的应用前景。 本次实验旨在通过基因工程技术构建原核表达质粒pGEX-4T-2/bFGF，并将融合质粒转入大肠杆菌表达GST-bFGF融合蛋白。pGEX- 4T–2是GST 融合蛋白的原核高效表达载体,因带有强的tac 启动子可诱导高效表达，并且载体内含有lac1阻遏蛋白基因，可用IPTG体外诱导表达。构建的质粒中,SD 序列下游是GST 基因,pGEX-4T-2的多克隆酶切位点位于GST