免疫学检测技术及其应用.pptVIP

免疫荧光技术 免疫组化技术 免疫印迹技术 — Western blotting法 免疫层析技术 — 金标免疫层析法 免疫测定技术 酶免疫测定法：ELISA 放射免疫测定法 化学发光免疫分析 酶免疫组化技术 免疫胶体金技术 免疫电镜技术 3、免疫标记技术 第三节 免疫细胞的检测 一、免疫细胞的分离 （一）外周血单个核细胞的分离 （二）淋巴细胞及其亚群的分离 1.玻璃粘附分离法 2.尼龙毛分离法 3.E花结分离法 4.免疫吸附分离法（洗淘法） 5.免疫磁珠分离法（IMB法） 6.流式细胞术分离法 常用的分离方法： 葡聚糖-泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）密度梯度离心法。 一、外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，它们是免疫学实验中最常用的细胞。 二、淋巴细胞及其亚群的分离 2、免疫磁珠（immune magnetic bead，IMB）分离法： 将已知抗淋巴细胞表面标志的抗体包被聚苯乙烯培养板，加入淋巴细胞悬液，使表达相应表面标志的淋巴细胞结合在培养板上，洗脱后即可获得具有相应表面标志的淋巴细胞。 例 用抗CD4抗体包被聚苯乙烯培养板，可将CD4+T细胞与CD8+T细胞相分离。 1、免疫吸附分离法（洗淘法）： 免疫磁珠由抗淋巴细胞表面标志的抗体与磁性微珠交联结合组成。 将免疫磁珠加入细胞悬液中后，可使表达相应表面标志的淋巴细胞与之结合。然后，在磁场作用下，结合相应淋巴细胞的免疫磁珠吸附在靠近磁铁的管壁上。弃去悬液中游离的细胞，将免疫磁珠结合的细胞分离，即可获得具有某种表面标志的淋巴细胞。 该法所获细胞纯度高（93%-99%），活细胞率＞95%，比流式细胞术省时、费用低，操作简单。 荧光激活细胞分类仪（简称流式细胞仪）集光学、流体力学、电力学和计算机技术于一体，可对细胞作多参数定量测定和综合分析。 是借助荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）将荧光抗体标记的细胞进行快速准确鉴定和分类的技术。 3、流式细胞术（flow cytometry）分离法： 程序原理 将待测细胞悬液与荧光素标记的抗体反应后，在压力作用下（细胞）排成单列经喷嘴喷出形成液滴射流（每个液滴包裹一个细胞）；在液滴射流与高速聚焦激光束相交处，液滴中细胞受激发光照射可产生散射光并激发各种荧光信号；荧光信号被光电检测器接受可转化为电信号；电信号经加工处理存储于计算机中，再用分析软件对数据进行统计处理和图像显示，快速准确获得结果。 流式细胞仪的主要用途 ①定量分析鉴定活细胞表面表达的特异分子； ②免疫细胞分类和百分计数； ③白血病和淋巴瘤的免疫学分型； ④细胞周期和细胞凋亡检测。 此外，流式细胞仪还具有分选功能，借助光电效应、微滴通过电场时出现不同偏向，可分类收集所需的细胞及其亚群。分选纯度高达95%以上，且可保持细胞活性，可进一步研究使用。 一、淋巴细胞功能测定 二、 免疫细胞功能测定 （一）T细胞增殖试验 1、特异性T细胞增殖试验： 2、非特异性T细胞增殖试验： （二）B细胞增殖试验 1、抗体形成细胞测定试验（溶血空斑试验）： 2、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）： （三）细胞毒试验 3、凋亡细胞检测法 2、乳酸脱氢酶释放法 1、51Cr释放法 形态学检测法 琼脂糖电泳法 TUNEL法 流式细胞术检测法 二、吞噬细胞功能测定 （一）中性粒细胞趋化功能的测定 （二）中性粒细胞吞噬功能测定 （三）巨噬细胞吞噬功能测定 一、淋巴细胞功能测定 第三节 免疫细胞功能测定 （一）T细胞增殖试验 T细胞增殖试验是检测机体细胞免疫功能常用的技术。 根据刺激物不同，T细胞增殖可分为两种方式： 1、特异性T细胞增殖试验： 用某种特异性抗原如结核菌素（OT）刺激相应抗原特异性 T细胞活化，并使之增殖。 2、非特异性T细胞增殖试验： 是用丝裂原（如PHA、ConA）或抗CD3单克隆抗体等非特 异性多克隆激活T细胞，并使之增殖。 在增殖过程中，细胞DNA、RNA、蛋白质合成增加，细胞形态改变，最终导致细胞增殖分化。 常用检测方法： （一）T细胞增殖试验 1、3H-TdR掺入法：