基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析).ppt

5′-磷酸核苷酸的基本结构 延伸中的DNA互补链分别终止于不同荧光标记的 ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP，四种连终止反应 可在一个试管中进行，并在同一条泳道中检测。 反应产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳中 按相差1个核苷酸大小的DNA片段长度顺序向下泳 动，当到达检测器时，激光探测仪发出激光，激 发DNA片段发出荧光,荧光信号传输至计算机便可 自动排列出DNA的核苷酸序列。 ddA ddG ddT ddG ddC ddC ddA ddC ddG ddT 激光激发 荧光信号 A G T G C C A C G T 电泳 链终止反应 序列结果： 红色代表 T ；绿色代表 A ；兰色代表 C ；黑色代表 G 。 测序仪ABI Prism310 Genetic analyzer实际测得的 一段DNA序列结果。 ABI Prism DNA Sequencer 3130 ABI Prism DNA Sequencer 3730 使用毛细管凝胶电泳分离链终止反应产物， 可大大增加测序的通量，根据毛细管的数量的 不同，一台仪器可同时完成96个样品或更多样 品的分析。 全自动测序具有较高准确性和安全性、操作 相对简单、可供大规模操作，而且，一次测序 反应提供的数据也增大。 一般同位素标记的测序只能读出200-300个核 苷酸序列；而荧光标记测序则可读出500-800个 核苷酸序列。 问题： 利用双脱氧链终止法测定DNA序列时，需要一段 已知序列的寡核苷酸引物。因此，对于一段未知序列的DNA片段，如何选择测序引物？ 一次测序只能读出800个核苷酸，对于较长的DNA 片段，如何测序？ 1.通用引物指导未知序列的测定 对于一段未知序列的DNA 片段，可以将其装载在载体 上，这样，待测DNA片段的 两端就相当于添加了已知序 列，因此，可根据载体序列 设计通用引物测定待测DNA 核苷酸序列。 2.引物步移测定大片段DNA核苷酸序列 在待测DNA片段中，如果知道部分核苷酸 序列，就可以根据该已知序列设计引物来测 定其相邻部位的序列，并可依次类推，直至 测出全部待测序列，这种方法称为引物步移 (Primer Walking)。 四、DNA序列的信息分析 寻找开放阅读框、预测外显子和内含子、分析调控 序列、在公共基因数据库中寻找相似的序列以及相似 性比较等； 1.基因序列的信息分析 预测RNA二级结构，计算折叠数等； 2.RNA结构分析 预测蛋白质的二级结构、三级结构及功能等。 3.蛋白质序列的信息分析 GenBank（美国）； 基因数据库及分析工具 基因数据库 EMBL（欧洲）； DDBJ（日本）； NCBI:（美国国家生物技术信息中心） 基因分析工具 EMBL:（欧洲生物信息学研究所） http://www.ebi.ac.uk Sanger中心:（基因组测序中心） ExPASy:（瑞士生物信息学研究所蛋白质分析系统） http://www.expasy.ch * * 基 因 工 程 生物技术专业核心课程 淮阴师范学院 高清松 基因功能的研究是生命科学中的主要课题； 基因测序是基因 操作中最基本的技 术之一。 其首要条件是获知目的基因的核苷酸排列顺 序，即基因测序。 第四节 DNA核苷酸序列分析 (Nucleotide sequence analysis) 基因测序方法 Maxam-Gilbert 化学降解法 双脱氧链终止法(Sanger 酶解法) 一、Maxam-Gilbert 化学降解法 1977年，A. M. Maxam和W. Gilbert首先 建立了 DNA片段序列的测定方法，由于该方 法是用特定化学试剂修饰不同碱基，并在相 应碱基处切断DNA片段而进行系列分析的,故 称之为Maxam-Gilbert化学降解法。 将一个DNA片段的5‘端磷酸基作放射性标记； (一)基本原理 分别采用不同的化学试剂修饰和裂解特定碱 基，从而产生一系列长度不一而5‘端被标记的 DNA片段； 通过凝胶电泳分离这些以特定碱基结尾的片 段群，再经放射自显影，就可确定各片段末端 碱基，从而得出目的DNA的碱基序列。 核心原理： 利用特定的化学试剂对不同碱基进行特异 性切割。 硫酸二甲酯： G 哌啶甲酸： G和A 肼+NaCl： C 肼： T和C 5′ 3′ 5′ 3′ 待测DNA G A+G C+T C 放射性标记5′末端 限制性酶切 R 变性 (放射性自显影只显示标记的单链) 特异性切割 G A+G C+T C 凝胶电泳分离， 放射自显影确 定末端碱基。 1. 标记：将待测DNA片段的5‘端磷酸基作放射性标记； (二)基本步骤