二酶的生产与分离纯化.docVIP

第2章 酶的生产与分离纯化 主要内容： 2.1 国内外酶制剂工业生产及应用现状 2.2 酶的发酵技术 2.3 酶的分离纯化 2.4 酶分离、纯化的评价 2.5 酶的剂型与保存 2.1国内外酶制剂工业生产及应用现状 2.1.1 ．新技术在生产中的应用： 三种方法： 组织提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶 微生物发酵：最大量的来源 化学及生物合成：生物重组 高新技术的应用：酶的修饰、固定化、基因重组、膜分离技术、冷冻干燥、微胶囊 2.1.2. 集中垄断，市场全球化： 规模企业由20世纪80年代初的80多家减少至20多家，占市场90% 丹麦诺和诺得公司（诺维信novozymes）→1978年进入中国诺维信公司，占50%市场（天津）； 美国杰能科公司（Genencor）→98年进入中国，与无锡合资，控股80%（无锡），两家公司销售额占全球2/3；（2005年杰能科国际公司被丹尼斯克公司收购）； 芬兰科特公司和丹麦丹尼斯克公司酶制剂业务合并，Pfizer，Rhone，SKW , Biosystems，日本天野 2.1.3. 品种、规模不断扩大 目前30多家600多个品种，应用于18个工业领域。 我国2000年酶制剂产量为30万吨，100家，市场份额仅占5%，以未经除菌去渣的粗制品粉状酶为主。 国际以液体、颗粒为主。 国内糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大类占了97%，显然不合理。 重要产品普鲁兰酶、真菌淀粉酶、系列果胶酶、低温碱性蛋白酶，国内尚未投入生产; 我国有7家上市公司介入酶制剂开发生产。 2.1.4. 应用领域不断扩大： 美国酶制剂年产值6.25亿美元，食品工业占62%，拓展饲料工业、洗涤剂工业、化学工业。 2.2 酶的发酵技术 利用微生物产酶的优点是： (1) 微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。 (2) 微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。 (3) 微生物培养基来源广泛、价格便宜。 (4) 可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。 (5) 可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种。因此，下面将主要介绍微生物发酵法产酶的一般原理和工艺。 2.2.1 产酶微生物 菌种是发酵生产酶的重要条件。菌种不仅与产酶种类、产量密切相关，而且与发酵条件、工艺等关系密切。已经在自然界中发现的酶有数千种，目前投入工业发酵生产的酶约有50～60种。它们的生产菌种十分广泛，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。 2.2.2 酶的发酵技术 2.2.2.1 培养基 培养基的营养成分是微生物发酵产酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是无机盐、生长因子和产酶促进剂等。 （1）碳源 碳素是构成菌体成分的主要元素，也是细胞贮藏物质和生产各种代谢产物的骨架，还是菌体生命活动的能量的主要来源。当前酶制剂生产上使用的菌种大都是只能利用有机碳 的异养型微生物。有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉质原料。此外，以石油产品中12 ～16 碳的成分来作碳源，如以某些嗜石油微生物生产蛋白酶、脂酶，均已获得成功。 不同的细胞对各种碳源的利用差异很大，所以在配制培养基时应根据不同细胞的不同要求而选择合适的碳源。另外，选择碳源除考虑营养要求外，还要考虑酶生物合成的诱导作用和是否存在分解代谢物阻遏作用。尽量选用具有诱导作用的碳源，尽量不用或少用有分解代谢物阻遏作用的碳源。 例如，α－淀粉酶的发酵生产中，应该选用有诱导作用的淀粉作为碳源，而不用对该酶有分解代谢物阻遏作用的果糖作为碳源。 （2）氮源 氮是生物体内各种含氮物质，如氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸等的组成成分。酶制剂生产中的氮源主要有有机氮源和无机氮 源两种，常用的有机氮源有：豆饼、花生饼、菜籽饼、鱼粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；无机氮源有：(NH4)2SO4 、NH4Cl 、NH4NO3 、(NH4)3P04 、尿素等。 不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要求进行选择和配制。一般来说，动物细胞要求有机氮，植物细胞主要要求无机氮。多数情况下将有机氮源和无机氮源配合使用才能取得较好的效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生产，只用铵盐或硝酸盐为氮源时，酶产量仅为有胨时的30% 。只用有机氮源而不用无机氮源时产量也低，故一般除使用高浓度有机氮源外尚需添加1%~3% 的无机氮源。 （3） 碳氮比 在微生物酶生产培养基中碳源与氮源的比例是随生产的酶类、生产菌株的性质和培养阶段的不同而改变的。 一