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布鲁氏菌实验室检测 微生物室 2013年8月 蚌埠 1、布鲁氏菌分离培养（抗原） 2、布病血清学检测（抗体） 3、分子生物学分型方法（菌株分型） 4、实验室生物安全和质量控制 1、布鲁氏菌分离培养 布鲁氏菌是一种革兰氏染色阴性、短小杆菌，无鞭毛， 不形成芽孢，一般无荚膜，毒力菌株可有菲薄的荚膜。 初次分离时多呈球状，球杆状和卵圆形，该菌传代培养 后渐呈短小杆状。 布鲁氏菌属于布鲁氏菌属（Brucella) 、 布鲁氏菌种（（Brucellae）。目前按照国 际分类标准，分为10个种19个生物型。常 见的有牛（B. abortus） 、羊（B. melitensis）、猪 (B. suis)、犬 (B. canis)、绵羊附睾(B. ovis)布鲁氏菌。 布氏杆菌为需氧或微需氧菌，最适生长温度37°C，最适 PH为6.6-7.4，牛种部分型别、绵羊附睾种布氏菌需在5- 10% CO2 条件下生长，初代分离菌株最好在CO2 条件下培 养。在普通培养基上生长不良，需用肝汤、胰蛋白胨肉汤、 马铃薯培养基、巧克力平板或特制的布氏菌培养基上生长。 此菌生长缓慢，初代培养常需5-10天甚至20-30天可见生 长。不过实验室长期传代保存的菌株或增菌液，培养24- 72h即可生长良好。 肝汤琼脂或胰蛋白胨琼脂上，菌落圆形光滑、初无色透 明，后渐浑浊而带灰白甚至灰黄色；菌落的发育大小常差 异较远，小者直径约０.１mm，大者可达２-３mm。在马铃 薯培养基上，菌落常现微棕黄色。布氏琼脂上的菌落无色 透明。在液体培养基中呈轻微浑浊，久后形成粘稠沉淀， 液面无菌膜，陈旧培养物有时可形成菌环。 血平板 布氏琼脂 可培养标本类型 可疑病人血液、尿液、乳液、脑脊液、关 节液、滑囊液 多采用血培养 血培养 无菌采血4~5ml静脉血接种双相培养基或血液增菌瓶。双相 培养基轻轻混合倾斜，血液均匀分布在琼脂面上，37℃培 养，血液增菌瓶混匀直接培养。普通培养箱和CO2培养箱（5%） 各一瓶。3天后观察结果，若可疑阳性，进行纯培养鉴定，30 天不生长为阴性。 尿液培养 用无菌的导尿管将尿液导入无菌容器中，为提高检出率，可 在尿液中加入1%~3%的高价血清，混合后37℃温育2h，高 速离心沉淀，取沉淀物0.5ml接种琼脂平板培养。 乳液、脑脊液、关节液、滑囊液培养 液体标本直接接种到琼脂平板或斜面上，15d无可疑菌落为 阴性。 鉴定 1.镜检涂片 2.特异性血清阳性：（A+M）、A、M、R血清凝集试 验(玻片、试管法） 3.染料抑菌试验（纸片法） 4.硫化氢试验（醋酸铅） 5.噬菌体裂解试验（BK2 ，Tb：0和4两个稀释度） 6.全自动生化仪鉴定（鉴定到种） 阳性血清玻片凝集 H2S产生试验-醋酸铅滤纸条与培基斜面平行 染料抑菌噬菌体裂解试验 Vitek2 Compact GN卡 2、布病血清学检测 试管凝集反应（SAT）推荐 虎红平板凝集试验（RBPT）推荐 抗球蛋白试验（Coombs试验）推荐 布氏菌素皮试试验（疫情，必要时） 全血玻片凝集反应（操作较RBPT难） 补体结合试验（复杂，敏感度低） 乳胶凝集试剂（敏感性差，较贵） 乳环凝集实验（局限性大） 金标检测（假阳性高，较贵） 酶联免疫吸附试验（IgG、IgM，可参考用） 试管凝集反应（SAT） 生理盐水稀释待检血清至 1:25、1:50、1:100、1:200， 1:400倍比稀释， 加入0.5ml抗原稀释液，摇匀，放 37℃温箱中24小时观察结果。判定结